PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
P
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.
Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.
Description
Keywords
Lactobacillus, Magnetické částice, Extrakce na pevné fázi, Izolace deoxyribonukleové kyseliny, Polymerázová řetězová reakce, Vysokorozlišovací analýza křivek tání, Lactobacillus, Magnetic particles, Solid-phase extraction, Deoxyribonucleic acid isolation, Polymerase chain reaction, High-Resolution Melting Analysis
Citation
KONEČNÁ, J. PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. .
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Potravinářská chemie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc., oponent (člen)
doc. RNDr. Andrea Ševčovičová, Ph.D., oponent (člen)
Date of acceptance
Defence
Ve své powerpointové prezentaci doktorandka představila podstatné výsledky své dizertační práce. Byly přečteny dva posudky a doporučovaly práci k obhajobě. Disertační práce je svou problematikou zaměřena na molekulární diagnostiku vybraných druhů bakterií mléčného kvašení, které jsou využívány v potravinářském průmyslu a jsou součástí probiotických preparátů. Zvolené téma disertace lze považovat za aktuální. Konkrétní dotazy jsou uvedeny na přiložených lístcích, které se archivují. V rámci všeobecné rozpravy vystoupila i konzultantka Dr. Trachtová, která kladně zhodnotila přístup doktorandky k dizertační práci.Doktorandka uspokojivým způsobem zodpověděla odborné dotazy oponentů uvedené v posudcích a členů komise vzešlé z diskuze. Nicméně doktorandka nepřikládala dostatečný význam připomínkám oponentů k formální stránce práce, která je v současné podobě nepřijatelná.
Je nezbytné přepracovat práci jakpo formální stránce (struktura a členění kapitol), tak i pro stránce vyhodnocení a interpretace výsledků a formulace závěrů. Komise doporučuje důsledně respektovat veškeré přiomínky oponentů. Komise dále doporučuje studentce přepracovat práci v co nejkratší době a požádat děkana o umožnení obhajoby ihned po odevzdání přepracované verze.
Result of defence
práce nebyla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení