Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Tato diplomová práce se zabývá autofluorescencí flavinů v gram-negativní bakterii Cupriavidus necator H16 a jejím mutantním kmenu PHB-4. Experimenty byly prováděny pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pro potvrzení přítomnosti flavinů byla změřena excitační a emisní spektra bakteriální suspenze, která se porovnala s flavinovými standardy. V části věnované testování buněk bez stresové odpovědi se měřila autofluorescence bakterií v PBS pufru a buněčné suspenze obarvené fluorescenční sondou BODIPY 493/503. Byl porovnáván poměr krátké doby života ku dlouhé době života autofluorescence a jeho závislost na přítomnosti fluorescenční sondy. Dále byla měřena autofluorescence supernatantu, kdy bylo zjištěno, že relativní zastoupení dlouhé doby života v extracelulárním prostředí je mnohonásobně vyšší než v intracelulárním. V části věnované stresové odpovědi se práce zaměřila na množství rozpuštěného kyslíku v produkčním médiu. Dále byl použit různě koncentrovaný peroxid vodíku, kdy nejlepší výsledky vykazovala koncentrace 100 mM. Pro porovnání s předchozími podmínkami se využila kombinace se síranem železnato-amonným, kde ale nebyl pozorován žádný rozdíl. Z látek ovlivňujících přímo dýchací řetězec byl použit azid sodný a antimycin A. Obě tyto látky měly vliv na změnu poměru relativního zastoupení dob života autofluorescence, ovšem rozložení těchto dob života a změnu rozložení autofluorescence v průběhu času ovlivňoval pouze azid sodný.
This thesis focuses on autofluorescence of flavins in gram-negative bacteria Cupriavidus necator H16 and its mutant strain PHB-4. The main methods used were fluorescence microscopy and flow cytometry. To confirm the presence of flavins, excitation and emission spectra of the bacterial suspension were measured, which were compared with flavin standards. In the part of testing cells without stress response, the autofluorescence of bacteria in PBS buffer and cell suspensions stained with fluorescence probe BODIPY 493/503 was measured. The ratio of short fluorescence lifetime to long autofluorescence lifetime, and its dependence on fluorescence probe was compared with previous conditions. Autofluorescence of the supernatant was measured; it was found that the relative amplitude of long lifetime was multiple times higher than in the cell. In the part devoted to the stress response, this thesis was focused on the amount of dissolved oxygen in the production medium and the effect on bacterial autofluorescence. Then differently concentrated hydrogen peroxide was used, the best results were obtained from the concentration of 100 mM in media. For comparison a combination of hydrogen peroxide with ferro-ammonium sulphate was used, but there was no big difference. Sodium azide and antimycin A were selected as substances that directly influence on bacterial respiratory chain. Both compounds affected change in the ratio of the relative amplitudes, but the distribution of these lifetimes and the autofluorescence change over time was affected only by sodium azide.
This thesis focuses on autofluorescence of flavins in gram-negative bacteria Cupriavidus necator H16 and its mutant strain PHB-4. The main methods used were fluorescence microscopy and flow cytometry. To confirm the presence of flavins, excitation and emission spectra of the bacterial suspension were measured, which were compared with flavin standards. In the part of testing cells without stress response, the autofluorescence of bacteria in PBS buffer and cell suspensions stained with fluorescence probe BODIPY 493/503 was measured. The ratio of short fluorescence lifetime to long autofluorescence lifetime, and its dependence on fluorescence probe was compared with previous conditions. Autofluorescence of the supernatant was measured; it was found that the relative amplitude of long lifetime was multiple times higher than in the cell. In the part devoted to the stress response, this thesis was focused on the amount of dissolved oxygen in the production medium and the effect on bacterial autofluorescence. Then differently concentrated hydrogen peroxide was used, the best results were obtained from the concentration of 100 mM in media. For comparison a combination of hydrogen peroxide with ferro-ammonium sulphate was used, but there was no big difference. Sodium azide and antimycin A were selected as substances that directly influence on bacterial respiratory chain. Both compounds affected change in the ratio of the relative amplitudes, but the distribution of these lifetimes and the autofluorescence change over time was affected only by sodium azide.
Description
Citation
MARKOVÁ, K. Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2018.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Chemie pro medicínské aplikace
Comittee
prof. Ing. Miloslav Pekař, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Petr Dzik, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (člen)
Date of acceptance
2018-05-28
Defence
Dzik: Do jako míry lze použitou metodu použít pro rozlišení živých a mrtvých buněk?
Pekař: Jaká je biogenní role fluoreskujících struktur ukázaných v prezentaci?
Márová: Jaké autofluoreskující struktury v buňce jste pozorovali? Jaký by byl fluorescenční projev cytochromů?
Zdráhal: Proč jste vybrali právě C. necator? Čím je významná?
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení