KUBOVÁ, N. Analýza mykotoxinů z biologických matric pomocí biomembrán a kapilární elektroforézy [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.

Posudek vedoucího

Duša,, Filip

Diplomantka vypracovala diplomovou práci zabývající se analýzou mykotoxinu pomocí moderní analytické metody využívající liposomy jako pseudostacionární fázi v elektrokinetické chromatografii. Praktická část této práce byla vypracována na Ústavu analytické chemie Akademie věd České republiky pod vedením Mgr. Filipa Duši, Ph.D. Diplomantka projevovala aktivní přístup po celou dobu řešení projektu. V průběhu řešení diplomové práce diplomantka s vedoucím konzultovala jak rešerši literatury, tak i průběh měření a naměřené výsledky. Diplomantka věnovala práci v laboratoři velké úsilí, což bylo nutné pro úspěšné zvládnutí vývoje metody pokročilého módu kapilární elektroforézy. Osvojení zručné a jemné manipulace a dávkování kapalin v mikrolitrových objemech bylo zásadní pro správnou přípravu liposomů a vzorků. Zároveň kultivace plísní a následná extrakce ochratoxinu A (OTA) byly náročné na správné naplánování a provedení všech úkonů. Těchto úkolů se diplomantka zhostila výborně. Výsledkem bylo vytvoření nové metody kapilární elektrokinetické chromatografie pro analýzu OTA, která disponuje vysokou rychlostí, nízkou pravděpodobností cross-kontaminace a velmi nízkými objemy pracovních roztoků a vzorků. Výsledky získané diplomantkou mají perspektivu pro budoucí vývoj metod s využitím dalších druhů detekce a pro analýzu podobných amfifilních mykotoxinů. Výsledná diplomová práce se skládá z 58 stránek a je rozdělena přibližně na poloviny do teoretické části a praktické části. Teoretická část zahrnuje podrobnou rešerši daného tématu pomocí aktuálně dostupné mezinárodní literatury. Výsledky jsou prezentovány především formou grafů a tabulek a diskutovány v textu. Práce je zpracována úhledně a má jednotný styl. Formálně odpovídá požadavkům kladeným na úroveň diplomové práce. Na základě výše uvedeného splňuje posuzovaná práce požadavky kladené na kvalitu a obsah diplomové práce a tímto ji doporučuji k obhajobě.

Posudek oponenta

Šesták,, Jozef

Práce se zabývá využitím kapilární lipozomální elektrokinetické chromatografie (LEKC) pro stanovení ochratoxinu A v biologických vzorcích. Po stručném úvodu následuje teoretická část pojednávající o výskytu OTA v potravinách, povolených limitech pro vybrané komodity, houbách produkujících OTA, prevencí a detoxikací OTA, a analytických metodách jeho stanovení. Teoretická část je zakončena kapitolou o lipozomech, což jsou uměle připravené sférické částice tvořené fosfolipidovou membránou, které plní funkci pseudo-stacionární fáze v LEKC. Experimentální část uvádí použité postupy kultivace hub a extrakce OTA, přípravu lipozomů a podmínky kapilární elektroforézy s UV-Vis detekcí. Ve výsledcích je popsána kultivace hub Aspergillus ochraceus Wilhelm a Aspergillus melleus Yukawa na žitě ozimém. Po kultivaci je materiál využit jako vzorek pro testování separační metody založené na LEKC. V rámci optimalizace separačních podmínek jsou testovány zejména vliv pH základního elektrolytu (BGE) a přítomnost lipozomů ve vzorku a v BGE. Experimentálně jsou stanoveny elektroforetické mobility OTA v módech LEKC a kapilární zónové elektroforézy (CZE), které jsou využity pro výpočet retenčního faktoru OTA pro tři různá složení lipozomů. Optimalizované podmínky LEKC jsou využity pro stanovení obsahu OTA v žitě ozimém po kultivaci hub v laboratorních podmínkách. Celkově lze konstatovat, že diplomová práce má přiměřený rozsah a formu a čerpá z velkého množství literárních zdrojů. Řešené téma je aktuální, jelikož přítomnost OTA v komoditách představuje pro člověka vážné zdravotní riziko a nová efektivní metoda stanovení jeho obsahu se může stát cenným nástrojem kontroly kvality. Výsledky práce demonstrují, že technika LEKC má pro toto využití potenciál a může se v budoucnu stát základem alternativní metody pro stanovení OTA v biologických materiálech. V práci lze nalézt několik menších nedostatků (viz. připomínky níže), které nikterak nebrání jejímu úspěšnému obhájení. Připomínky k práci: - Jsou chybně uvedené jednotky maximálních limitů pro obsah OTA v komoditách jako ng/kg tělesné hmotnosti. Správná jednotka je µg/kg komodity (str. 9). - Asociační konstanta OTA-Albumin 107 l/mol má být 10 000 000 l/mol (str. 10). - Elektrická síla působící na iont není sumou náboje a intenzity el. pole, jak je uvedeno na str. 25, nýbrž jejich součinem. - Některá tvrzení v textu by měla být podpořena prezentací dat – UV absorpční spektra, elektroforeogramy (napr. důvod výběru detekční vlnové délky a složení BGE). - Některé části textu jsou velmi stručné (např. kapitola 1.4.1.1), případně obtížně srozumitelné (např. kapitola 1.4.2.3.1). - Grafy 1 a 2 znázorňují mobilitu OTA, nicméně popis os Y odkazuje na EOF. - Chybí vysvětlení zkratek AFT, CIT, SFE, UPLC. - Klíčová zkratka v práci odkazující na lipozomální elektrokinetickou chromatografii (LEKC) je uváděna nesprávně jako LECK a v seznamu symbolů nesprávně vysvětlena jako „lipozomálna elektroforetická kapilárna elektroforéza“. - Výpočet celkové koncentrace v žitném zrnu není korektní (kapitola 4.4.1). Původní methanolový extrakt byl rozdělen na dva stejně velké podíly, které byly dále různě zpracované (jeden rozpuštěn ve vodě, druhý v methanolu) a v některých případech bylo zjištěné množství OTA v analytickém vzorku významně rozdílné. Ve stejně velkých podílech extraktu by množství OTA mělo být zhruba stejné. V případě značného rozdílu výsledků množství v podílech tedy nelze využít obě hodnoty (jedna z nich bude nutně zatížena nadměrnou chybou). Výpočet koncentrace OTA v původním vzorku by správně měl vycházet pouze z dat získaných při použití jednoho typu rozpouštědla. - Větší množství odkazů na literaturu citovanou v textu není následně uvedeno v seznamu použité literatury. Otázky k obhajobě: 1. Jaká může být rychlost analýzy vzorků a spotřeba rozpouštědel pomocí metody na bázi LEKC v porovnání se zavedenými HPLC metodami? 2. Lze blíže nastínit možnosti snížení limitů detekce metody založené na LEKC pro stanovení obsahu OTA? 3. Lze v současném uspořádání systému pro LEKC uvažovat využití MS detekce?

eVSKP id 116130