KROUSKÁ, J. Interakce hyaluronanu a povrchově aktivních látek [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2012.
Disertační práce Jitky Krouské je součástí výzkumu zaměřeného na potenciální aplikace hyaluronanu v nosičových systémech, tedy koloidech či nanokoloidech použitelných k (cílenému) transportu biologicky aktivních látek, zejména léčiv. Výzkum byl zčásti podpořen domácím výrobcem hyaluronanu a akcí COST (v domácím i evropském měřítku). Disertace byla zaměřena hlavně na tenziometrické a kalorimetrické studie interakcí hyaluronanu s tenzidy jako základními složkami jednoho z možných nosičových typů. Doplněna je úvodní studií interakcí hyaluronanu s jednoduchými aminokyselinami potenciometrickou titrací. Doktorandka přistupovala k plnění zadaných úkolů svědomitě a zodpovědně. Aktivně vyhledávala literární informace a komunikovala zejména se zahraničním pracovištěm (Lublaň, Slovinsko), kde část experimentální práce realizovala. Své výsledky pravidelně a průběžně prezentovala zejména na mezinárodním fóru, především v rámci workshopů a konferencí pořádaných související akci COST. Práce obsahuje originální výsledky nejen z hlediska "domácího" hyaluronanu, ale i z hlediska obecného pohledu na chování tohoto zajímavého biopolymeru. Část výsledků již byla publikována i v mezinárodním vědeckém časopise, rukopis dalšího článku s další částí výsledků byl (bohužel) dokončen až s dokončením vlastní disertace v termínu řádné doby studia. Přístup doktorandky hodnotím celkově kladně, výsledky sebrané v disertaci jako přínosné, doporučuji práci přijmout k obhajobě.
Autorka předložené disertační práce studovala možné interakce hyaluronan (sodný ?) a povrchově aktivních látek, nebo aminokyselin za použití různých metod. Přínosem je jistě skutečnost, že část práce byla vykonána na univerzitě v zahraničí. Téma práce je velmi aktuální vzhledem k postupnému používání hyaluronanu v medicíně. V teoretické části práce podala autorka stručný přehled jak o vlastnostech, získávání a použití kyseliny hyaluronové jako takové, tak také o doposud publikovaných poznatcích z oblasti interakcí HA a povrchově aktivních látek. Použitá literatura je vesměs velmi aktuální. Předložená práce je velmi přehledně a jasně zpracována. S uvedenými závěry je možno souhlasit. Práce je doplněna seznamem publikací, kde jsou použity výsledky autorčiny experimentální práce; významná je její aktivní účast na konferencích. Svou prací prokázala autorka schopnost samostatné vědecké práce a získané výsledky publikovat v zahraničních časopisech i přednést na konferencích. Předností je zpracování celé práce v angličtině. Práci doporučuji k obhajobě.
Dizertační práce Ing. Jitky Krouské se zabývá vlivem hyaluronanu na micelizaci tenzidů. K tomuto studiu byly použity různé fyzikálně-chemické metody. Byly zvoleny dva kationaktivní tenzidy, a to tetradecyltrimethylammonium bromid (TTAB) a cetyltrimethylammonium bromid (CTAB). Pro stanovení entalpie micelizace autorka použila metodu izotermní titrační kalorimetrie. Povrchové vlastnosti vzorků zkoumala za pomocí tenziometrie. V práci sledovala také vliv různé molekulové hmotnosti použitého hyaluronanu a vliv délky alkylového řetězce tenzidu. Výsledkem byly hodnoty kritické micelární nebo agregační koncentrace tenzidu. Práce sama je koncipována obvyklým způsobem, kdy obsahuje teoretickou a praktickou část. V příloze jsou dvě publikace, z nichž jedna již vyšla v uznávaném vědeckém impaktovaném časopise v daném oboru a druhá je zřejmě předložena redakci k posouzení. U již publikovaného materiálu lze předpokládat, že prošel úspěšně důsledným oponentním řízením. Druhý článek je napsán přehledně, bez zřejmých pochybení a bude s vysokou pravděpodobností publikován v budoucnu. Text práce je napsán s vysokou odborností, poukazující na aktuální problémy a limity v daném vědním oboru. Pro nezaujatého čtenáře působí velmi kvalitně a dobře se čte (text je „tekutý, hutný a někam směřuje“). Toto jasné a srozumitelné zpracování práce dokazuje schopnosti autorky a adekvátní orientaci ve studovaném oboru. Po formální stránce k práci nemám žádných připomínek. Na závěr konstatuji, že předložená dizertační práce má dle mého názoru vynikající úroveň. Autorka vzhledem ke kvalitě předložené práce splňuje veškerá požadovaná kritéria a osvědčila, že je dostatečně vyzrálou osobností. Tyto důvody mě tedy vedou jednoznačně k závěru, že: DOPORUČUJI aby po úspěšné obhajobě dizertační práce byl Ing. Jitce Krouské přiznán titul Ph.D.
The main part of the work focus on studies of interaction between hyaluronan of various molecular weights in the range 90-1800 kDawith cationic surfactants, mainly CTAB (Mw=365) and TTAB (Mw=336) by tensiometry and isothermal titration microcalorimetry. In one shorter study the interaction of Hyaluronan with the acids 6-amino caproic acid and L-lysine, by pH titration method with strong acid and conductiometric measurements. The possible application as drug delivery systems is discussed. Indeed this is a very relevant and interesting topic as a fundamental understanding of the interaction between the relevant constituents will add to our understanding of drug delivery, and possibly also guide in the design of such products. Various methods were used to study the interaction, but mainly tensiometry according to the du Noüy ring method and the bubble pressure methodand isothermal titration calorimetry. The basic idea was to study the influence of hyaluronan on the CMC of the surfactants. Qualitative information of interaction between the different components studied in the thesis was obtained and discussed. Tensiometric studies Interaction of CTAB and TTAB with Hyaluronan of 90 and 1400kDa at 0.15 M NaCl, 25C. Tensiometric measurements according to the du Noüyring methodshowed an influence of hyaluronan of the surface tension of both CTAB and TTAB that could be explained by an interaction between the components, since the equilibrium between the bulk and interface would most certainly be affected by an interaction. However, no shift in the CMC was observed as might have been expected by an interaction. On the other hand fluorescence methods did indicate a shift toward higher CMC for CTAB in the presence of hyaluronan of both molecular weights. Interaction of CTAB with Hyaluronan of 116 and 1730 kDa in pure water at 25C. This study was complicated by a gel formation that may be characterized as a sol-gel transition of the CTAB-hyaluronan system below the CMC. Just as with the case with salt solution, the presence of hyaluronan lowers the surface tension relative to the pure surfactant indicating an interaction between the surfactant and the hyaluronan. Interesting information was obtained with the bubble pressure method at different bubble lifetime for the surfactant/hyaluronan vs. the pure surfactant system. At least qualitatively the results indicated different elastic behavior with and without hyaluronan, again suggesting that there is an interaction indeed. Perhaps there is more information that one can gain from similar studies relating to the elastic properties of the system. Just as with the measurements with the salt solution in the previous section, the ring method showed a decrease in the surface tension as hyaluronan was added to CTAB, but again no shift in the CMC was observed. Similar measurements with TTAB showed equivalent behavior as compared to those of CTAB. Discussion point: Determination of CMC indirectly by tensiometry. With the du Noüyring method the surface tension of the gas-liquid interface of the cuvette is measured as a function surfactant concentration. At concentrations below CMC the tension decreases with added surfactant in a more or less linear fashion as the concentration of the surfactant at the interface increases. When the CMC is reached and beyond the surfactant molecules are instead used to form micelles. This will inevitably cause a break in the slope of surface tension vs. concentration curve. This break in the curve will be relevant if the surface is not saturated with surfactant. An interesting discussion might be at which surfactant concentration this will occur for a given surface to volume ratio of the cuvette. Discussion point:The use of the bubble pressure method creates formation of bubbles or foam on top of the liquid solution. There will certainly be a concentration of surfactant molecules at the interface of the liquid film of the bubbles. The total amount might not be significant compared to the amount in the bulk below the CMC, but it might anyway be interesting to discuss this possible source of error in the measurements. Microcalorimetric studies The micelle formation of CTAB and TTAB was studied by ITC with and without the presence of hyaluronan (116 and 1800 kDa) in pure water as the matrix. In order to do this with ITC the surfactant was loaded into an injection syringe at a concentration above the CMC. When the solution is diluted by injecting stepwise into a larger volume the micelles break up and the endothermic heat effects associated with this process is measured. The surfactant solution is discretely added until the CMC is reached in the calorimetric cell and beyond. Figure 35 in the thesis shows a nice example with TTAB. The CMC value is taken as the inflection point of the heat vs. concentration graph. In cases of significant interaction between hyaluronan and the surfactant, the heat of a micellization as well as the CMC would be expected to change, making ITC a powerful tool to characterize the interaction. Indeed changes in the characteristics of the calorimetric data was observed and especially pronounced when the concentration of hyaluronan was 1000 mg/ml compared to 15 mg/ml. The data was complicated by the sol formation and subsequent sol-gel transition as the effect from these processes potentially adds to the overall heat effects. This is due to the non-specific nature of heat measurements, i.e. most processes are accompanied by either heat evolution or heat absorption. Nevertheless, the data clearly indicate interaction, so again from a qualitatively point of view we can conclude that there is a significant interaction of the system. Further on, the shift in the critical aggregation concentration (CAC) as estimated form the ITC curves showed an influence of the surfactant chain length, and thus the hydrophobicity of the surfactant. The longer the chain length of the surfactant, the higher the CAC was observed, an observation that fits with theory, as pointed out in the thesis. Discussion point: The “cloud formation” as well as the demicellization and interaction with the hyaluronan add up to the total measured heat. The clouding could explain the initial slope of the curve and the gel formation might explain the exothermic dip towards the end of the slope attributed to the CMC.In order to get a more quantitative description of the interaction surfactant-hyaluronan, one could assume that it would be possible to set the concentration such that a full interaction saturation curve could be generated below the CMC. In this way one might be able to get information on binding affinity as well as stoichiometry. Interaction between hyaluronan and amino acids In the last study reported the interaction of amino acids, 6-amino caproic acid and L-lysine with hyaluronan was investigated by using a strong acid, HCl, as a probe for the various structures of single components and mixtures. In this way HCl was consecutively added to the different solutions while the pH and the electrical conductivity were measured. On a qualitative basis, interaction between the acids and the two molecular weight hyaluronan studied could be assessed. Final discussion point: The thesis discusses the use of the studied system in drug delivery. Indeed, from a fundamental point of view this is very interesting. An important aspect when considering the use of various compounds as excipients in pharmaceutical formulations is the position of the main regulatory agencies like EMEA or FDA. An interesting discussion point might be to what extent these regulatory agencies have approved the use of the compounds discussed in the thesis. I hereby recommend the author of the reviewed thesis to be awarded the academic title "Ph.D".
eVSKP id 59689