HRUDÍKOVÁ, R. Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve streptococcus equi subsp. zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2020.
Oponentský posudek dizertační práce Ing. Radky Hrudíkové „Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve Streptococcus Equi Subsp. Zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR“ Vypracoval RNDr. Jan Bobek, Ph.D. Práce Ing. Hrudíkové se věnuje diferenciální genomové a expresní analýze dvou kmenů Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, které se komerčně využívají pro produkci kyseliny hyaluronové. V práci byly použity moderní přístupy sekvenace genomu i celogenomové exprese genů metodami NGS, qPCR a microarrays. Následné analýzy získaných dat byly zaměřeny především na osvětlení zvýšené produkce hyaluronové kyseliny u zkoumaného kmene CO4A. Téma je aktuální i vzhledem k tomu, že získané poznatky mohou být okamžitě komerčně využitelné. Práce splňuje nadefinované cíle. K práci mám následující připomínky a několik dotazů: • V názvu práce na str. 2 je streptococcus psán malým písmenem. V oficiálním názvu jsou naopak všechna počáteční písmena názvu organismu velká. Správně začíná rodový latinský název velkým písmenem a druhový malým a píše se kurzívou. • V práci bylo objeveno několik mutací či rozdílné exprese genů, které by mohly mít vliv na produkci HA. Ovšem překvapivě vůbec se nevěnuje rozdílům v expresi oblastí genomu nekódujících proteiny. Přitom právě bakteriální malé sRNA jsou důležitými regulátory genové exprese a mohou různé metabolické dráhy přímo ovlivňovat. • Anotace i úvod celé práce je napsán dobře a dobře uvede čtenáře do studované problematiky i výsledků. Nicméně autorka u těchto dvou kapitol opakuje některé pasáže. • Jaké máte dle výsledků pro firmu doporučení pro další navýšení produkce HA? • V teoretické části jsou použité obrázky z jiných prací. Reference jsou uvedeny. Nicméně hned u obr. 1. je obrázek překopírován z jiného zdroje, než je uvedeno. • V textu je uváděn gen gpi, ale pravděpodobně jde o pgi, tedy gen pro fosfoglukoizomerázu? • „Jako negativní kontrola pro analýzy qPCR byla zvolena cDNA připravená z celkové RNA bakterie Escherichia coli DH5.“ Je vždy velice dobré používat negativní kontroly k prováděným experimentům. Nicméně mám připomínku ke správnosti užití takové negativní kontroly, kdy ani není možné předpokládat pozitivní výsledek. V případě qPCR jde asi nejvíc o to vyloučit možnost kontaminace chromozomální DNA, která zkresluje získaná expresní data. Můžete takovou kontaminaci u svých vzorků vyloučit? Jakou negativní kontrolu byste za tímto účelem použila? • Analýza Ct hodnot vybraných skupin genů metodou 2(-Ct). Byl studován i vliv suplementace média GlcNAc na expresi genů. Data byla normalizována k expresi genu gyrA. Můžete vyloučit možnost, že přítomnost GlcNAc ovlivní expresi tohoto referenčního genu, což by ve finále zkreslilo získaná data? • Výsledky a diskuse celé práce jsou shrnuty v jediné kapitole. V tomto případě, kdy se jedná o zhodnocení velkého počtu dat, je dle mého názoru takové členění oprávněné. • Z hlediska úrovně české gramatiky je práce psaná dobře, nicméně lze najít chyby, a to především v interpunkci. Jako příklad uvádím následující větu: „Změny v nukleotidové sekvenci mohou mít vliv na tvorbu sekundárních struktur mRNA a tím signifikantně snížit efektivitu exprese aniž by došlo ke změně v sekvenci aminokyselinového řetězce [131].“ Jinde se jedná o věty neukončené, např. tím, že chybí sloveso: „Mutace identifikovaná v genu Sesec_00473 (IleVal), který kóduje chaperon DnaK.“ • U problematiky DnaK chaperonu (str. 37) bych se ještě pozastavil. Uvádíte, že může mít vliv na patogenicitu a stresovou rezistenci u streptokoků. Můžete prosím tento mechanismus, dle uvedené reference, konkretizovat? • Pozorovala jste nějaké morfologické rozdíly mezi oběma studovanými kmeny? Např. na str. 55 a 65 i jinde uvádíte rozdílné exprese genů, které by mohly mít vliv na syntézu peptidoglykanu. Nepozorovala jste tedy např. rozdílnou tloušťku buněčné stěny? • Na str. 97 (a jinde) nejsou uvedeny celé názvy enzymů eno, pyk, ldh; názvy genů by měly být kurzívou, názvy proteinů velkým písmenem. • Str. 93 i dále: „Lipoteichoová kyselina je stejně jako kyselina hyaluronová jedním z virulentních faktorů a povrchový protein [133, 146].“ Nejsou to proteiny, větě nerozumím. • Grafy 8-28: popis a vysvětlení grafů je nedostatečné. Jaká byla změna v expresi genů bez a po suplementaci GlcNAc? V práci studentka analyzovala množství sekvenčních a expresních rozdílů z naměřených dat a nad získanými výsledky vede cílenou a přesvědčivou diskusi. Nicméně práci (i z mého pohledu proto, aby mohla být dobře opublikovaná, viz. níže) chybí jakýsi finální experiment, který by nás mohl přesvědčit o efektivitě celého výzkumu, např. na základě dosavadních výsledků navrhnout mutaci referenčního kmene, která by přímo mohla ovlivnit produkci HA. Studentka ve svém CV uvádí své spoluautorství 4 článků publikovaných v impaktovaných časopisech a jednoho patentu. Ani v jednom případě však není první autorem. Ani jedna z uvedených publikací se přímo netýká problematiky dizertační práce. Navíc dvě z těchto čtyř uváděných prací nejsou vědecké články, ale jedná se jen o konferenční abstrakty (Abstracts of the 17th European Congress on Biotechnology). Ponechávám na rozhodnutí komise, zda je tato skutečnost překážkou k úspěšné obhajobě. Pokud ne, tak z mojí strany nejsou jiné námitky a mám za to, že studentka prokázala tvůrčí schopnosti v dané oblasti výzkumu a práce splňuje požadavky standardně kladené na disertační práce v daném oboru. V Curychu dne 24. 8. 2020
eVSKP id 120282