BENKOVSKÁ, D. Proteomické studie ječmene související s výrobou piva [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2013.
V rámci disertační práce, která byla vypracována na Ústavu analytické chemie AV ČR, v. v. i., Ing. Dagmar Benkovská studovala proteiny zrna ječmene a jednotlivých meziproduktů sladovnického a pivovarnického procesu. Rovněž se zabývala porovnáváním různých odrůd ječmene a analýzou glykosylací proteinů ječmene a sladu. Získané výsledky přinesly užitečné informace pro potravinářský průmysl a zemědělství, například pro šlechtění nových odrůd ječmene. Ing. Benkovská také optimalizovala a aplikovala nové postupy analýzy proteinů, které mohou být využity pro další studium. Jednoznačně mohu konstatovat, že Ing. Benkovská prokázala schopnost analytického myšlení, ochotně věnovala práci značné úsilí a množství času. Při své experimentální práci projevila vysoký stupeň pracovitosti, samostatnosti, pečlivosti a zodpovědnosti. Jednoznačně lze ocenit přesnou experimentální práci a aktivní přístup k vyhodnocování a interpretaci získaných výsledků, které byly publikovány v mezinárodních časopisech. Ing. Benkovská splnila všechny předepsané povinnosti, a proto disertační práci doporučuji k obhajobě.
Předložená disertační práce byla vypracována na Ústavu analytické chemie AV ČR pod odborným vedením dr. J. Bobáľové, CSc. Práce je zaměřena na využití moderních instrumentálních technik k charakterizaci pivovarských surovin a k následnému využití poznatků v průběhu technologie výroby piva. Cílem práce byla zejména separace proteinových frakcí ječmene pomocí elektromigračních a chromatografických technik a analýza pomocí proteomických technik a MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Byly sledovány změny složení frakcí proteinů v průběhu pivovarského procesu včetně charakterizace posttranslačních modifikací, zejména glykosylací. Disertační práce je sepsána na celkem 130 stránkách textu v anglickém jazyce. Obsahuje 5 příloh, z toho dvě odborné a ve třech přílohách životopis a přehled odborných a publikačních aktivit autorky. Práce je členěna standardně, je rozdělena celkem do 10 základních kapitol představujících úvod do problematiky, teoretické aspekty, cíle práce, metodický přehled, výsledky s diskusí, závěry, přehled literárních odkazů, seznam zkratek a přílohy. Text je sepsán jazykově velmi dobře, s minimem chyb a překlepů, čitelně a srozumitelně. V teoretické části práce je obsaženo velmi stručné uvedení do problematiky proteomické analýzy, posttranslačních modifikací proteinů a jejich významu v organismu. Dále je stručně pospán proces výroby piva s ohledem na proteiny ječmene a jejich změny v průběhu sladování. Dále jsou zde rozebrány možné metody analýzy proteomu pomocí chromatografických a elektromigračních metod a používané postupy identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie. Hlavní cíle jsou formulovány jasně, jednoznačně a koncepce práce je stanovena v logické návaznosti. V experimentální části je třeba ocenit inovativní přístup při optimalizaci a vývoji moderních metod analýzy komplexních proteinových směsí včetně identifikace složek. Zajímavé jsou též výsledky identifikace jednotlivých proteinů, zejména enzymů a inhibitorů proteáz v průběhu sladování. Práce je doplněna 115 literárními odkazy, většinou na aktuální separátní literaturu a elektronické zdroje. Citace jsou uváděny v souladu s platnou normou. Výsledky byly publikovány v celkem 6 vědeckých publikacích, z toho 5 prací bylo uveřejněno v mezinárodních časopisech s IF. U dvou prací je ing. Benkovská uvedena jako první autor, u ostatních jako spoluautor. Dále byly výsledky součástí 11 konferenčních příspěvků, u 6 z nich je ing. Benkovská první autorkou. Během dosavadní činnosti získala ing. Benkovská též 4 ocenění vědecké práce. Závěrem lze konstatovat, že kandidátka Ing. Dagmar Benkovská jednoznačně prokázala předloženou vysoce kvalitní disertační prací schopnost samostatné odborné práce a vyhovuje tak požadavkům platné legislativy. Na základě uvedených skutečností doporučuji disertační práci k obhajobě a po úspěšném obhájení udělení titulu PhD.
Autorka předložené disertační práce Ing. Dagmar Benkovská si vybrala jako objekt svého studia velmi významný rostlinný druh. Ječmen je totiž světově významnou obilninou, v některých zemích má důležité místo jako základ denní stravy (nekvašené chleby, placky apod.). V České republice je druhou nejpěstovanější obilninou, avšak z hlediska lidské výživy má význam minoritní.V současné době je však zaznamenána renesance jeho využití v lidské výživě, z důvodu pozitivního zdravotního efektu spočívajícího v obsahu zdravotně prospěšných látek v obilce a také z pohledu chemického složení zelené biomasy. Plochy pěstovaného ječmene v ČR se pohybují v posledních šesti letech mezi 300 – 400 tisíci hektary, což představuje produkci 1 až 1,5 mil t zrna ročně. Produkce ječmene ještě nedávno byla ze 75 % zkrmována monogastry, v současnosti je více jak polovina produkce spotřebovávána k výrobě sladu a téměř třetina produkce se exportuje. Slad je použit pro domácí výrobu piva a rovněž je ve velké míře exportován, ročně cca 250 tis. t. Již z názvu práce, který prostupuje organicky vlastní prací, je cítit praktické použití výsledků a smysl disertační práce. Obsah proteinů v obilce je jedním ze základních sladařských kritérií, ovlivňujících sladování, výrobu i kvalitu piva. Je známo, že se proteinová skladba obilky a množství a množství proteinů při procesu sladování a varného procesu výrazně mění. Avšak proteinový komplex obilky ječmene a zejména jeho chemické změny jsou velmi složitou a dosud neprobádanou oblastí. Je tedy záslužné a potřebné, že se Ing. Dagmara Benkovská zaměřila na proteomiku ječmene. Cílem této disertační práce bylo přispět k obohacení poznatků o změnách bílkovin v obilce ječmene a později v technologii jejího zpracování, s důrazem na proteiny rozpustné ve vodě. Disertační práce je napsána na 126 stranách včetně příloh v jazyce anglickém a má obvyklé požadované členění. Autorčina znalost jazyka jistě přispěla ke kvalitě práce, neboť se dobře orientovala v zahraniční literatuře a mohla ji tak dokonale využít. Ing. Benkovská použila pro literární rešerši a diskusi 116 literárních pramenů převážně zahraničních, nejnovějších publikací, zveřejněných v renomovaných vědeckých časopisech. Je příznivé pro celkové hodnocení disertační práce, že kapitola Výsledky a diskuse zaujímá větší rozsah než kapitola Literární rešerše. Takový poměr svědčí o svědomitém přístupu autorky k vypracování disertace, který se projevil rovněž na množství použitých metod a rozsahu experimentální práce. Z kapitoly Výsledky a diskuse je možné posuzovat schopnost autorky formulovat vlastní výsledky a konfrontovat je s dostupnými výsledky, což je důkazem autorčiny vědecké erudice. Tato kapitola je tématicky rozčleněna podle skupin proteinů v práci studovaných a dále podle použitých metod. Autorka použila ke studiu prolaminů několik velmi moderních a specifických metod za použití moderní přístrojové techniky, která jí byla na Ústavu analytické chemie AV ČR k dispozici. Autorka provedla velké množství proteomických analýz, musela řešit náročné separace proteinů ze zrna ječmene a sladu. Zvláštní pozornost věnovala autorka disertace vybrané skupině posttranslačních modifikací proteinů ječmene: glykosylacím. To je z pohledu procesu sladování velmi významné, neboť neenzymaticky glykosylované (glykované) proteiny ječmene jsou tvořeny v samém průběhu sladování. V souvislosti s kvalitou konečného výrobku – piva je jejich poznání důležité, neboť mají bezprostřední vliv na kvalitu piva, tím že ovlivňují stabilitu proteinů a kvalitu piva. Autorka musela pro analýzy obohacovat matrice glykoproteiny, neboť jak je známo, je jich v rostlinných materiálech minimální množství přestože hrají klíčovou roli v důležitých biologických funkcích. Z profesního hlediska mne zaujala subkapitola výsledků, týkající se ječných prolaminů – hordeinů a albuminů. Jedním z cílů autorky bylo studium a vyhodnocení diferencí v profilu nízkomolekulárních ve vodě rozpustných proteinů u tří odrůd. Jednalo se o dvě sladovnické odrůdy doporučované pro výrobu Českého piva a jedna odlišná, nová, bezpluchá odrůda AF Lucius. Tato je české provenience a patří do kategorie odrůd určených především k potravinářskému využití. Jedinečným je výsledek této části studia proteinů zjištěný autorkou, neboť použitou metodou zjistila rozdíl spekter mezi odrůdami sladovnického a odrůdou nesladovnického typu. Takže metoda se jeví vhodnou i pro stanovení odlišnosti odrůd. Autorka získané poznatky publikovala v prestižním časopise Journal of the Institut of Brewing, který je středem zájmů odborníků v dané oblasti využití produkce ječmene. Oceňuji specifický přístup Ing. Benkovské k analyzovanému materiálu z pohledu genetického, tj, použitých odrůd. Ne vždy jsou v chemickém výzkumu takto definovány matrice, zejména ty, které se používají pro optimalizaci metod, což bylo také součástí práce autorky disertace. Těší mne, že genetický materiál studovaný během činnosti Výzkumného centra pro studium obsahových látek ječmene a chmele (1M0570) na AF MENDELU v Brně byl dále využíván v práci Ing. Benkovské. Tak se směry výzkumu ječmene započaté právě ve jmenovaném centru zúročují dále na pracovišti Analytického ústavu Akademie věd v Brně. Z předložené disertace je vidět pozitivní odborný vliv školitelky Ing. Janetty Bobálové, CSc., která vedla výzkumné kroky Ing. Benkovské a pokračuje se tak kontinuálně na úseku vědy, který byl započat Ing. Bobálovou a je velmi potřebný. Ing. Dagmar Benkovská publikovala v několika prestižních impaktovaných časopisech i v českém odborném časopise, určeném pro odbornou sladovnicko-pivovarskou veřejnost. Několik nalezených nepřesností v textu práce (uvádím následovně) naprosto nesnižuje kvalitu předložené práce.: V abstraktu (českém i anglickém): - Drsné podmínky během vaření piva .... formulovala bych: „teplotně nevhodné podmínky pro stabilitu proteinů“ - Odrůdy povolené pro výrobu certifikovaného Českého piva...... Má být uvedeno: Odrůdy doporučené pro výrobu piva s chráněným zeměpisným označením „České pivo“ Závěr Výsledky, které jsou uvedeny v předkládané disertační práci obohacují poznatky z oblasti proteomiky ječmene, jsou přínosem jak pro oblast teoretického poznání, pro metodologii studia proteomu ječmene, tak pro praktické využití odrůd ječmene jarního. Velký význam mají pro vlastní zpracování ječmene při sladování a technologických procesech výroby piva. Autorka prokázala schopnost samostatné tvůrčí práce, prokázala schopnost vědecky pracovat a výsledky publikovat ve vědeckých časopisech. Předložená, kvalitně vypracovaná doktorská disertační práce splňuje veškeré požadavky vyplývající ze zákona č. 111/98 o vysokých školách. Proto d o p o r u č u j i předloženou doktorskou disertační práci Ing. Dagmar Benkovské k obhajobě. Po úspěšné obhajobě doporučuji komisi pro obhajobu doktorské práce udělit autorce předložené práce akademický titul „doktor“, ve zkratce Ph.D.
Ve své disertační práci se Ing. Dagmar Benkovská zabývá využitím proteomických technik při studiu změn proteinového složení během zpracování ječmene při výrobě piva, Detailní popis změn v proteinovém složení může významně přispět k zlepšení technologie výroby piva a tím i kvality finálního produktu. Positivně hodnotím i snahu o navržení rychlé a instrumentálně nenáročné metody pro charakterizaci sladových odrůd ječmene pomocí LC separace vodou extrahovatelných proteinů obsažených v zrnu. Práce je podložena pěti publikacemi v odborných časopisech s impaktním faktorem (plus jednou publikací bez IF), z toho u dvou je Ing. Benkovská uvedena jako první autor. Současně se Ing. Benkovská aktivně účastnila domácích i mezinárodních konferencí. Práce je dobře členěna, doplněna množstvím citací. Oceňuji, že text je až na několik vyjímek bez zbytečných formálních chyb. Na základě prostudování disertační práce mám tyto poznámky: • str. 15 – chybně uvedený sekvenční motiv místo A-X-C je správně N-X-C • str. 25 – v popisu SDS –PAGE (2.2.1.1) mi chybí zmínka o fluorescenčním barvení, které je dnes běžně používáno • str. 26 – nesouhlasím s tvrzením „... IPG strip gels that have recently replaced tube gels...“ trubičkové gely pro IEF se prakticky nepoužívají poměrně dlouho, odhaduji min. 10 let • str. 27 – v kap. 2.2.1.3 není zmíněna DIGE, která otevírá nové možnosti 2D GE a je zavedena již několik let • str. 29 – nepřesná formulace „.. source of ions – in a vacuum converts...“, API iontové zdroje pracují za atmosferického tlaku, vakuum musí být striktně při ostatních krocích MS analýzy, tam uvedeno není • str. 29 – nepřesná formulace „ ...ESI is suitable for analysis of complex mixtures.“ ESI také trpí potlačovacími efekty v případě přítomnosti více analytů současně v iontovém zdroji, to co umožňuje jeho využití pro analýzu komplexních směsí je snadné on-line spojení s vysoce účinnou separací • str. 30 – nepřesná formulace „...The first TOF analyzer selects the precursor ion,....“ Prekursor pro MS/MS analýzu je vybírán pomocí iontového selektoru na základě MS analýzy v prvním TOF analyzátoru. • str. 35 – v současné době lze pomocí iTRAQ značit až 8 vzorků, ne jen 4 • str. 49 – v kap. 4.10.3 by měla být uvedena kriteria za kterých byl protein či peptid považován za signifikantně identifikován, např. zda jsou uvedeny proteiny identifikované na jeden nebo více unikátních peptidů se signifikantním skore, zda byla použita p – 0,05 nebo striktnější hodnota. Osobně bych uvítal, pokud by byla hodnota skore uvedena u všech reportovaných peptidů v příslušných tabulkách i s hodnotou limitního skore pro dané prohledávání v popisu a % pokrytí sekvence u proteinů, aby bylo možné si udělat představu o kvalitě identifikace • str. 65 – odkaz na kap. 0 – tu jsem nenašel • str. 77 – chyba v popisku Fig.30, místo 2019 má být 2619 Závěrem mohu prohlásit, že i přes dílčí připomínky, práce splňuje kritéria doktorské disertační práce k získání vědecké hodnosti Ph.D. a doporučuji ji k obhajobě.
eVSKP id 68079