VLAHOVÁ, V. Analýza trankripčních variant genu TP 53 v lidských leukemických buňkách [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2013.

Posudek vedoucího

Malčíková,, Jitka

Veronika Vlahová se v rámci své diplomové práce věnovala samostatnému úkolu navazujícímu na větší projekt zpracovávaný v laboratořích CEITEC MU a Fakultní nemocnice Brno. Cílem práce bylo studium sestřihových variant nádorově významného genu TP53. Cíle práce se autorce podařilo naplnit prokázáním existence dosud nepopsané sestřihové varianty genu v primárních nádorových buňkách i buněčných liniích. Při vlastní experimentální práci se potýkala s problémem samostatně pracovat a plánovat experimenty. Na druhé straně při zpracování teoretické části práce prokázala velmi dobrou schopnost orientovat se v zahraniční literatuře a dokázala nastudovat a samostatně zpracovat velké množství publikovaných dat. Konzultací studentka využívala pravidelně. Celkově hodnotím předloženou diplomovou práci známkou velmi dobře - B.

Posudek oponenta

Mgr.Diana Grochová, Ph.D.

Diplomová práce Bc. Veroniky Vlahové se zabývá analýzou transkripčních variant genu p53, konkrétně izoformou p53 u chronické lymfocytární leukémie (CLL). Autorka zavedla analýzu této varianty pomocí metody PCR a na souboru vzorků od pacientů s chronickou lymfocytární leukémií prokázala přítomnost p53 v B-lymfocytech těchto pacientů. Dále se zabývala analýzou dosud nepopsané zkrácené varianty p5316. Tyto výsledky budou zcela jistě přínosné pro pracoviště, na kterém byla provedena experimentální část diplomové práce a budou sloužit jako výchozí bod pro další zkoumání těchto izoforem. Celkově je práce na dobré úrovni. Jednotlivé kapitoly jsou přehledně strukturované, citace jsou zpracovány pečlivě, mohly být však zvoleny více aktuální články k dané problematice. Výsledky jsou originální a přínosné. V práci je jen pár překlepů, nepřesností (např. str. 13 p53 stimuluje transkripci proteinu p21/správně: stimuluje transkripci genu pro p21, str. 24- u obrázků 12 a 13 by bylo vhodné sjednotit jazyk, kterým jsou pojmenovány typy mutací) či byly použity nesprávné výrazy (např. str. 14- indukce apoptózy skrze protein p53/místo slova skrze by bylo vhodnější použít např. prostřednictvím, str. 43- místo slova „fotka“ použít „fotografie“ nebo „obrázek“) . V celém textu je také potřeba používat jednotnou nomenklaturu genů a proteinů. Vzhledem k tomu, že se autorka ve své experimentální části diplomové práce zaměřila na analýzu izoformy p53 u CLL, postrádám v úvodní teoretické části detailnější popis a shrnutí nejnovějších poznatků o funkci, výskytu a souvislosti této izoformy s nádorovými procesy a CLL (o p53 je napsáno pouze osm vět). Naopak detailní popis modelového organismu Danio rerio (str. 20) nemá souvislost s daným tématem a je nelogicky zařazen do této práce. Z experimentální části je patrné, že autorka zvládla řadu molekulárně-biologických technik, od zpracování krve, izolace RNA z B-lymfocytů a její přepis do cDNA, následně přípravu PCR, restrikční štěpení a kontrolu produktů pomocí elektroforézy v agarózovém gelu či DNA čipu. Nicméně popis metod v experimentální části je poněkud nesourodý a pro to, aby metody mohly sloužit jako návod pro další pracovníky, chybí v řadě případů důležité údaje (např. v kapitole 4.3.3 chybí časový údaj u uchování buněčného lyzátu při -80C po přidání TRI reagentu, chybí údaj o objemu přidávaného BCP, isopropanolu, 75% etanolu nebo vody, ve které je pelet rozpuštěn, dále v kapitole 4.3.4 není zcela jasné jaký je výsledný objem PCR atd.). Kapitola s výsledky je nejsilnější částí diplomové práce. Získané výsledky jsou popsány přehledně a zdokumentovány řadou obrázků a tabulek a diskuze k nim je adekvátní. Mám pouze dotaz k obrázku 24 a související tabulce 14 – jedná se v případě pozice 14 opravdu o vzorek pacienta č. 27? I přes veškeré připomínky, které by měly spíše sloužit jako inspirace a podnět pro další práci studentky, hodnotím diplomovou práci Bc. Veroniky Vlahové kladně a doporučuji ji k obhajobě. Navrhuji hodnocení známkou velmi dobře. Otázky do diskuze: 1)Několikrát se v textu zmiňujete, že primery F a R jsou specifické pouze pro izoformu p53. Jakým způsobem jste sekvenci primerů získala a jak jste ověřila, že jsou specifické pro p53 a ne i pro jiné izoformy p53 (nebo jak by takové ověření probíhalo)? V případě, že by se amplifikovaly i jiné izoformy, věděla byste, jak tomuto předejít (tj. jak pozměnit reakci, nebo jakou jinou metodu zvolit) a do jaké míry by tento fakt mohl ovlivnit Vaše výsledky? 2)Co si myslíte o fyziologické funkci izoformy p53 a její úloze v nádorovém procesu? 3)Zkusila jste analyzovat pomocí Bioanalyzeru (DNA čipu) i vzorek plasmidu 363/3, který obsahuje variantu p5316 (popř. odpovídaly velikosti specifických fragmentů této varianty fragmentům detekovaných u vzorku MEC-1 – obrázek 30 a 31)?

eVSKP id 51670