KONEČNÁ, J. PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. .
Vzhledem k tomu, že školitelka ani konzultant nedodali posudek školitele, byly využity doslovné podklady z databáze Apollo týkající se aktivit studentky a plnění plánu studia v jednotlivých letech dle vyjádření školitelů. 2014/15 Časový plán disertační práce: V průběhu akademického roku bude rozpracována literární rešerše k problematice disertační práce a poznatky budou využity experimentálně při práci v laboratoři. Výsledky vědecké práce budou publikovány na konferencích a odborných setkáních ve formě posterů nebo přednášek. Budou složeny naplánované odborné zkoušky. Plnění plánu: Byla vypracováno plakátové sdělení v anglickém jazyce, která bude prezentováno na 6. ročníku konference Chemistry & Life 2015. Hodnocení školitele: Doporučuji pokračovat v doktorském studiu. 2015/16 Časový plán: V průběhu akademického roku bude pokračováno v experimentální práci. Pozornost bude zaměřena na využití poznatků z bioinformatiky. Výsledky vědecké práce budou publikovány na konferencích a odborných setkáních ve formě posterů nebo přednášek. Budou složeny naplánované odborné zkoušky. Plnění plánu: Pedagogická činnost: Výuka předmětu Praktikum z biotechnologie Odborná stáž: Srpen 2016: Studijní stáž v Bratislavě Účast na konferencích: Prosinec 2015 - Účast na Studentská odborná konfererence Chemie je život 2015 v Brně – přednáška v anglickém jazyce Září 2016 - Účast na konferenci Chemistry towards Biology Brno 2016 – poster Hodnocení školitele: Výsledky práce byly prezentovány na vědeckých konferencích a publikovány v odborném časopise. Doporučuji pokračovat ve studiu. 2016/17 Plán (stejný jako v předchozím roce): V průběhu akademického roku bude pokračováno v experimentální práci. Pozornost bude zaměřena na využití poznatků z bioinformatiky. Výsledky vědecké práce budou publikovány na konferencích a odborných setkáních ve formě posterů nebo přednášek. Budou složeny naplánované odborné zkoušky. Plnění plánu (vyplnil školitel): Bylo pokračováno v experimentální práci na FCH. Získané výsledky nebyly dosud v dostatečné kvalitě vyhodnoceny a zpracovány. Totéž se týká i výsledků z předcházejícího období? Doktorská zkouška dosud složena nebyla. Celkově hodnotím práci studentky v tomto roce jako velmi slabou - uspokojivě. Část výsledků získaných během zahraničního pobytu byla publikována formou posteru. Bylo zpracováno pojednání pro doktorskou zkoušku. Z těchto důvodů doporučuji pokračovat ve studiu. V roce 2017 studentka absolvovala 6-měsíční stáž na Univerzitě Huelva ve Španělsku, kde byla i součástí týmu prezentujícího výsledky na konferenci. Hodnocení školitele: Vzhledem k nedostatečné aktivitě týkající se experimentální práce na FCh a vzhledem k tomu, že dosud nebyla složena státní doktorská zkouška, celkově hodnotím studentku jako velmi slabou. Studentka odevzdala Pojednání a přihlásila se ke státní doktorské zkoušce a proto doporučuji pokračovat ve studiu. 2017/18 Plán: V průběhu akademického roku bude pokračováno v experimentální práci. Studium odborných článků k tématu disertační práce. Příprava vlastní publikace v impaktovaném časopise. Pokračování v experimentální činnosti v rámci tématu disertační práce, analýza výsledků. Výsledky vědecké práce budou publikovány na konferencích a odborných setkáních ve formě posterů nebo přednášek. Plnění plánu: -složení SDZ - sepsání disertační práce Absolvování konference - ŠVK PriF UK Bratislava (poster, rozšířený příspěvek ve sborníku - High resolution melting analysis for identification of strains beloging to the Lactobacillus casei group) Práce na projektech pod CMV - Laboratoř anorganických materiálů Dokončení experimentů v rámci disertační práce Příprava publikace do mezinárodního časopisu Hodnocení školitele: Studentka věnuje velmi málo času úkolům souvisejícím s disertační prací. Část výsledků, které měla předložit do konce roku 2016(!) dosud nepředložila, stejně jako do 31.7. nepředložila žádné výsledky z tohoto roku. Celkově studentku hodnotím opakovaně jako velmi slabou. S touto skutečností byla opakovaně seznámena oborová rada. Výsledky na konferenci studentka publikovala bez konzultace se školitelkou. Připomínky školitelky týkající se disertační práce či publikace studentka ignoruje. Nedoporučuji pokračovat ve studiu. Stanovisko školitele z posledního roku studia bylo podpořeno i dopisem děkanovi FCH, kde se školitelka zříká povinnosti vypracovat posudek (kopie dopisu je přiložena). Brno, 28.11.2018 prof. RNDr. I. Márová, CSc. Předseda OR DSP CHTP
Disertační práce Jany Konečné je svou problematikou zaměřena na molekulární diagnostiku vybraných druhů bakterií mléčného kvašení, které jsou využívány v potravinářském průmyslu a jsou součástí probiotických preparátů. Vzhledem ke stále se zvyšujícímu významu probiotik pro udržení zdraví člověka je žádoucí znát vlastnosti jednotlivých bakteriálních druhů a současně mít vhodné metody pro jejich identifikaci a kvantifikaci, což umožňuje posoudit deklarované složení a tím i kvalitu probiotických potravin. Zvolené téma disertace proto považuji za aktuální. Konkrétně bylo cílem práce optimalizovat podmínky adsorpce a eluce DNA na magnetické nosiče využívané pro izolaci DNA a její následnou analýzou pomocí PCR prokázat přítomnost jednotlivých druhů bakterií v reálných vzorcích, a dále v případě probiotických bakterií prokázat též přítomnost specifických genů týkajících se probiotických vlastností. Dalším cílem bylo využít k identifikaci bakterií mléčného kvašení též metodu HRM-PCR. Práce je sepsána v českém jazyce na103 stranách. Je rozčleněna na teoretickou část, kterou představuje rešerše z literárních zdrojů shrnující základní informace o probiotických bakteriích, struktuře jejich genomu, kde je pozornost věnována zejména genům týkajícím se zejména probiotických vlastností. Následuje charakterizace antimikrobiálních látek, které mohou být produkovány některými druhy těchto bakterií a přispívat tak k jejich probiotickým vlastnostem. Závěr je pak věnován metodikám používaným k analýze probiotických mikroorganismů. Po teoretické části následuje část experimentální, rozdělená na podkapitoly Materiál, Metody a Výsledky a diskusi - tyto jsou uváděny zvlášť pro izolaci DNA pomocí magnetických částic a zvlášť pro analýzy pomocí HRM-PCR. Každá z těchto dílčích částí obsahuje též shrnutí označené jako Závěr a diskuse. Úvodní část svědčí o tom, že se autorka seznámila s řešenou problematikou a s metodami, které jsou pro detekci a charakterizaci probiotických bakterií využívány. K sepsání čerpala z rozsáhlého souboru odborných článků, jak vyplývá z uvedeného přehledu literatury. V úvodu experimentální části je představen soubor používaných kmenů r. Lactobacillus a Streptococcus pocházejících ze sbírek mikroorganismů (Univerzita v Ljubljaně a ČSM na MU) a dále pak již izolovaná DNA z kmenů Bifidobacterium, která byla poskytnuta školitelkou uchazečky. Jsou popsány zdroje a vlastnosti použitých magnetických nosičů, dále pak testované probiotické výrobky a chemikálie. V kapitole Metody je popsána kultivace bakterií, postupy použité pro izolaci DNA z bakteriálních kultur a probiotických preparátů (fenolová extrakce, komerční soupravy, magnetické částice) a jsou uvedeny podmínky, které byly pro optimalizaci těchto postupů optimalizovány. V následující části metod je pak představena instrumentace pro PCR a HRM-PCR, podmínky, za nichž byly analýzy prováděny včetně sekvencí primerů pro amplifikaci.a detekci produktů. Následující kapitoly představují dosažené výsledky získané při řešení dílčích úkolů. Jako první je hodnoceno testování podmínek adsorpce modelové DNA z kuřecích erytrocytů na magnetické částice a její následná eluce při změnách složení a pH pufrů a volbě magnetických částic. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách, kde jsou uvedena množství navázané a eluované DNA a rovněž její čistota jako důležitý parametr pro následné analýzy. PCR a HRM-PCR – výsledky těchto analýz jsou pak prezentovány formou elektroforetogramů (PCR) a křivek tání (HRM-PCR). Celkově jsou dosažené výsledky rozděleny do několika kapitol a podkapitol, jejichž číslování postrádá systém, takže je pro čtenáře obtížné se v nich orientovat. Za zásadní problém však považuji závěry (resp. informace uváděné jako závěry), které jsou formulovány z hodnocení dílčích postupů – jako příklad uvádím konstatování. na str. 52 (nahoře) v kapitole 10.4. Závěr a diskuse, kde je jako jeden ze závěrů uvedeno: Byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Po amplifikaci všech DNA byly prokázány specifické produkty PCR pro doménu Bacteria. Produkty PCR byly různé intenzity v závislosti na množství DNA ve směsi pro PCR. Podobně:na téže straně níže: „Použití různých hodnot pH (7, 7.6 a 8) fosfátového pufru v separační směsi neovlivnilo množství DNA, která se navázala na magnetické částice. Pro další využití byl vybrán fosfátový pufr pH 7,6“. Následuje sdělení, že ani „...doba navázání DNA (co to je?) na magnetické nosiče ... neovlivňuje množství DNA navázané na magnetické částice...“. Takto formulované věty nepřináší jednoznačnou informaci. Pokud je kapitola nazvána Závěr a diskuse, očekával bych, že získané výsledky budou konfrontovány (tj. diskutovány) rovněž z výsledky jiných autorů, což ovšem chybí. Týká se to i závěrečné kapitoly 10.8., která je nazvána stejně (Závěr a diskuse). Dále bych upozornil na to, že v kapitolách Závěr a diskuse nemohou být opakovány metodické záležitosti – tak je tomu v kapitole 10.6 ve druhém odstavci, kde je uváděn postup měření koncentrace DNA. Z mnoha pochybení, která se v práci vyskytují, uvádím jen některá: U jména autorky na titulní straně je uveden titul Mgr (což je podle jejího CV patrně správné), na obálce je ovšem Ing. Co je důvodem? Má rovněž titul Ing? Některé stránky nejsou očíslovány, což komplikuje orientaci v práci (např. u str. 35, 36, 46, 71, 84, 81, a řada dalších). Str. 24, 25. a 26. Autorka nedefinuje jednoznačně co je to magnetický nosič, magnetická částice (resp. mikro- a nano- částice). To je třeba upřesnit vzhledem k tomu, že jsou v experimentech používány. Str. 13 a jinde – jsou vynechány odkazy na citace pod čísly 4 a 6, na str. 16 odkaz na citaci 20 atd. Str. 35. Podle názvu práce („Probiotické geny potravinářsky významných bakterií mléčného kvašení“) bych očekával , že práce bude přednostně zaměřena na detekci a analýzu genů u probiotických bakterií, zejména těch, které se nacházejí ve funkčních potravinách. V hlavních cílech práce na str. 35 je pouze zmíněn průkaz genů pomocí magnetickýách nosičů, v závěru a diskusi na str. 89 nejsou výsledky týkající se analýzy genů zmíněny prakticky vůbec. Buď by se měl změnit název práce, nebo její obsah. Str. 35, 46 z jakého důvodu byla pro optimalizaci metody izolace DNA zvolena DNA z kuřecích erytrocytů a nikoliv bakteriální DNA? Str. 46 je uveden odkaz na kapitolu v části Metody 7.3 – tato kapitola v práci ale není. Stejně tak není v práci kap. 8.3.3, na niž se odkazuje na str. 46 a 47 (tab. 4 je v kap. 9.3.3). Str. 46. které magnetické částice byly použity pro testování (tab. 10 a 11)? Str. 47. na obr. 11 chybí standard velikosti kontrola (vzorek bez použití magnetických částic) Str. 48 odkaz na metody 7.3 – kapitola chybí, viz výše. Str. 51 složení směsí pro PCR - odkazuje se na tabulky v kap. 8.5 – tam jsou chemikálie, složení směsí je v tab. 7 v kapitole 9.5. Str. 52. je uvedeno, že pH pufru ani doba neovlivňují navázání DNA. Proč nebyly použity kratší intervaly, aby se ukázal časový průběh adsorpce? Str. 52 a 53. Není jasné srovnání výsledků podmínek adsorpce a eluce testovaných pro DNA z kuřecích erytrocytů a bakteriálních vzorků. Na str. 53 je vágní závěr, že ...“Díky těmto částicím bylo naizolováno větší množství DNA ve větší kvalitě“ – co se rozumí větší kvalitou? Str. 56 Ve druhém odstavci se jedná o metodický popis, který do závěru ani do diskuse nepatří. Str. 72 Věta „Produkt amplifikace....umožnil surovou diskriminaci bakterií křivek tání... díky sekvenční variabilitě fragmentů“ je zcela zmatečná. Výsledky PCR pro druhovou identifikaci bakterií a pro detekci genů jsou prezentovány na velkém množství elektroforetogramů. Podobně je to s prezentací výsledků analýz metodou HRM-PCR (křivky tání). Domnívám se, že je zbytečné prezentovat všechny tyto výsledky grafickou formou. Ve většině případů se jedná o testování různých podmínek pro optimalizaci těchto metod, a prezentovány měly být finální výsledky (tak jak je to běžné při uvádění výsledků ve vědeckých článcích). Ve stávající podobě je čtenář nucen probírat se řadou obrázků a tabulek s často nevýstižným nebo nekompletním popisem, kdy se při hodnocení výsledků kombinují různé parametry: teplota, metoda izolace DNA a složení pufrů pro adsorpci a eluci. Legendy k obrázkům a tabulkám by měly umožnit porozumět jejich obsahu bez nutnosti nahlížet do textu. Do vysvětlivek je třeba uvést, co uváděné údaje vyjadřují. Své výsledky autorka prezentovala na 8 tuzemských či zahraničních konferencích, jak dokládá seznam abstrakt z těchto konferencí. V jakém stádiu se nachází publikace předložená do impaktovaného časopisu, která by měla být stěžejním výstupem řešení disertační práce? Škoda, že nemohu posoudit i rukopis této publikace. Závěr: Z předložené práce je zřejmé, že uchazečka vykonala značný kus experimentální práce, bohužel však dosažené výsledky a závěry prezentuje formou, která není vyhovující. Vzhledem k neúměrnému počtu formálních a věcných pochybení, která se vyskytují ve všech kapitolách práce, je potřeba všechny výše uvedené nedostatky odstranit. V současné době je obtížné práci posoudit z hlediska splnění plánovaných cílů. Celkový závěr: Práci doporučuji k obhajobě, současně však doporučuji důkladnou revizi a odstranění všech výše uvedených nedostatků. Prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. Ústav experimentální biolofioe PřF MU Kotlářská 2 611 37 Brno V Brně 25. 11. 2018
eVSKP id 113581