ILLKOVÁ, K. Možnosti mikrobiální degradace a využití odpadů z potravinářských výrob [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2012.
Doktorandka Ing.Katka Illková začala pod mým vedením pracovat na problematice disertační práce pod názvem „Možnosti mikrobiální degradace a využití odpadů z potravinářských výrob“ ve školním roce 2007/2008. Velmi rychle zvládla základní experimentální postupy související s praktickou částí disertace. Jednalo se hlavně o osvojení základních laboratorních dovedností souvisejících s kultivací a přípravou mikrobiálních enzymů, které byly nevyhnutné pro další laboratorní experimenty. Za účelem splnění cílů disertační práce a rozšíření si znalostí ze studované problematiky strávila řadu měsíců na odborných stážích na Chemickém ústavu SAV v Bratislavě, který patří k významným pracovištím v dané vědecké oblasti. S řadou experimentálních technik se seznámila rovněž na Analytickém ústavu AVČR v Brně. Výsledky své experimentální práce prezentovala v rámci odborných konferencích v ČR a SR. Při své práci prokázala iniciativní přístup k řešení experimentálních problémů, jakož i schopnost pracovat ve vědeckém týmu.
Téma predkladanej dizertačnej práce je aktuálna, rieši problematiku spracovania, odstránenia, využitia vedľajších produktov vznikajúcich pri potravinárskej výrobe a čím sa zároveň usiluje o riešenie úlohy v oblasti ochrany životného prostredia. Téma sa prikláňa k dosiahnutiu výsledkov v tzv. bezodpadových technológiách. Zadaním práce bolo popísať možnosti mikrobiálnej degradácie odpadov z potravinárskych výrob a sledovať produkciu technologicky významných enzýmov. Predkladaná dizertačná práca je rozdelená do viacerých kapitol (úvod, teoretická časť, cieľ práce, experimentálna časť, výsledky a diskusia, zoznam použitých zdrojov), ktorým nebolo v práci priradené číslo a boli vypracované s použitím 183 citácií odbornej literatúry. Teoretická časť práce bola zameraná na oblasť Odpady rastlinného pôvodu (štruktúry, enzýmová degradácia, produkcie mikrobiálnych enzýmov na odpadoch, produkcia pektolytických enzýmov, matolíny) a na oblasť Odpadové vody (spôsoby čistenia odpadových vôd, organické znečistenie odpadových vôd, odbúravanie lipidov, lipolytické enzýmy, a mikrobiálna degradácia lipidov v odpadových vodách). Cieľ práce bol vymedzený v širšom texte, kde doktorandka mala cieľ sledovať využiteľnosť potravinárskych odpadových materiálov ako potenciálneho zdroja uhlíka na rast mikroorganizmov a s tým súvisiacu produkciu hydrolytických enzýmov. Následne cieľ práce aj ostatné kapitoly (experimentálna časť, výsledky a diskusia) boli rozdelené na dve oblasti skúmania a to na: produkciu, izoláciu, a identifikáciu polygalakturonáz s možnosťou využitia odpadov z vinárstva pre rast Geotrichum candidum a na časť: charakterizácie komerčného prípravku odbúravajúceho lipidy v potravinárskych odpadových vodách a návrh nového prípravku na tento účel, návrh vhodných mikrobiálnych druhov. Výsledky práce doktorandky sa dosiahli najprv porovnaním získaných a opublikovaných výsledkov prác autorov Stratilová z rokov 2006, 2008 resp Taskin a Stratilová, 2008, v ktorých autori uviedli produkčné kmene polygalakturonáz získané, ale na rôznych iných zdrojoch uhlíka ako sú navrhované hroznové výlisky – matolíny. Na základe nameraných výsledkov stability polygalakturonázy na hroznových výliskoch kmeňom Geotrichum candidum CCY 16-1-29 sa výsledky práce zameriavajú na charakterizáciu len týchto polygalakturonáz. Testy boli uskutočňované na štyroch typoch kultivačných médií s rozdielnym zložením fermentačného média a rôznym pracovným postupom (miešanie, zalievanie), čo sa prejavilo aj na produkcii farbiva a morfológii testovaného kmeňa , čo prinieslo aj nový poznatok práce v tejto oblasti (morfológia buniek nebola doteraz popísaná). A zvolil sa vybraný nový postup na kultiváciu s prídavkom minerálnych solí a kvasničného autolyzátu s použitím solid state kultivácie. A uskutočnila sa produkcia, izolácia, charakterizácia extracelulárnych polygalaktuironáz (pH optimum, teplotné optimum, tepelná stabilita, stanovenie spôsobu účinku, stanovenie izoelektrického bodu, čiastočná purifikácia, stanovenie molekulových hmotností, analýza čiastočne purifikovaných proteínov, identifikácia pektolytických enzýmov na základe primárnych štruktúr), ktoré boli porovnávané a diskutované s výsledkami prác iných autorov v tejto oblasti výskumu pre vzorky vybrané z 3. a 7. dňa kultivácie. Produkcia lipáz: Je časť výsledkov dizertačnej práce. kde sa najprv doktorandka zameriava na štúdium komerčného prípravku SanyDuo využívaného degradovať lipidy v odpadových vodách. Štúdium sa zameriava na dôkaz lipolytickej aktivity mikroflóry komerčného prípravku na rôzne lipidové substráty. A záver určuje, že lipolytická aktivita bola ovplyvnená zložením substrátov. Olivový, palmový, repkový a slnečnicový olej boli použité ako lipidové substráty pre modelové odpadové vody. Doktorandka sledovala vplyv pH, teploty na produkciu lipáz (komerčného prípravku) do prostredia fermentačného média. Vyhodnocovala organické znečistenie odpadových vôd hodnotami chemickej spotreby kyslíka. A prídavok palmového oleja bol vyhodnotený ako najlepšie degradovateľný substrát. Vykonávali aj identifikáciu mikroflóry prítomnej v komerčnom prípravku Dielčie dosiahnuté výsledky sú v práci uvedené formou obrázkov, tabuľky a grafických závislostí. Testovanie vybraných bakteriálnych kmeňov pre vývoj nového prípravku do odlučovačov tukov. Na základe získaných výsledkov z hodnotenia komerčného prípravku pri sledovaní teploty a pH boli využité na hodnotenie vybraných mikrobiálnych kmeňov už získané, namerané, optimálne hodnoty pH aj teploty na rast, produkciu lipáz. Dosiahnuté výsledky meraní boli v práci uvedené tabuľkami a obrázkami. Ďalší poznatok bol získaný sledovaním vplyvu prítomnosti tenzidov v odpadových vodách na produkciu lipáz. Pokus bol nastavený tak, že do fermentačného média bol pridaný Tween 20 v rôznych koncentráciách a následnými meraniami sa dosiahli pozoruhodné výsledky Doktorandka Ing. K. Illková splnila plánované ciele dizertačnej práce, čoho dôkazom sú vypracované jednotlivé kapitoly s výsledkami a následnou diskusiou s prácami iných autorov publikujúcich výsledky výskumu v oblasti technologicky významných enzýmov. Do odlučovačov tukov boli navrhnuté druhy Bacillus subtilis, Geobacillus thermocatenulatus, Geobacillus thermodenitrificans a zmesná kultúra Therrmus a Bacillus používané v čističke odpadových vôd. Záver: Môžem konštatovať, že doktorandka Ing. Kateřina ILLKOVÁ svojou dizertačnou prácou preukázala spôsobilosť samostatne riešiť vedeckovýskumné úlohy a dokázala priniesť nové poznatky pre prax. Napriek všetkým uvedeným pripomienkam, práca spĺňa podmienky stanovené príslušnými predpismi pre udelenie vedecko-akademickej hodnosti philosophiae doctor. Na základe toho o d p o r ú č a m predloženú dizertačnú prácu prijať a po úspešnej obhajobe jej udeliť vedecko-akademickú hodnosť philosophiae doctor.
Disertační práce je sepsaná na 114 stranách a řeší v dnešní době velice aktuální problematiku znečišťování životního prostředí, konkrétně odpadového hospodářství v potravinářském průmyslu. Celá práce je rozdělená do dvou okruhů a zabývá mikrobiální degradací odpadních matriálů. První část se věnuje využitelností odpadů (hroznových výlisků) z vinařství a druhá odpadním vodám se zvýšeným obsahem lipidů. V úvodní části autorka podala informaci o produkci biologicky rozložitelného odpadů při zpracování révy vinné a povinnosti zpracovatelů v této souvislosti dodržovat příslušnou legislativu. Obdobně je nutno zabezpečovat požadavky na kanalizační řád a emisní limity i pro odpadní vody ze zařízení společného stravování. Zde nacházejí využití mikroorganismy, kterým odpadní materiál slouží jako zdroj uhlíku a současně mikroorganismy mají schopnost odpady svou enzymovou aktivitou hydrolyzovat. Literární přehled je rozdělen do dvou částí odpovídající obsahové náplní práce, kde první část se věnuje odpadům rostlinného původu, složení odpadů, degradací jednotlivých složek, produkci mikrobiálních a pektolytických enzymů a druhá část se zabývá čištěním odpadních vod – způsoby čištění, odstraňování tuků z odpadních vod, odbourávání lipidů a činností lipolytických enzymů. Hlavní složkou odpadů rostlinného původu jsou polysacharidy, které jsou hlavním zdrojem uhlíku pro mikroorganismy produkující enzymy štěpící polysacharidy. Degradace může probíhat v tekutém médiu, které je neustále třepáno nebo provzdušňováno se současným mícháním (submerzní kultivace), nebo kultivaci mikroorganismů na zvlhčeném pevném substrátu bez přítomnosti volné vody (solid state fermentation, SSF). Odpady z potravinářských výrob mohou být čištěny mechanicky, chemicky nebo biologicky. Biologický způsob odbourávání lipidů je další část literární částí práce, čemu se autorka věnuje, včetně struktury a mechanismu účinku lipas. Cíle práce jsou formulovány jasně a autorka je rozdělila do dvou oblastí. Prvním cílem bylo sledovat využitelnost odpadů z vinařství za působení kvasinkových mikroorganismu Geotrichum candidum a vzniku pektolyických enzymů, olygalakturonas, jejích izolace a identifikace. Druhým cílem předložené práce bylo testování komerčního přípravku pro degradací lipidů, identifikovat mikrobiální kultury použitého komerčního přípravku a navrhnou složení nového preparátu. V experimentální částí zabývající se enzymy polygarakturonas charakterizuje autorka odpadní materiál, použité mikroorganismy, kultivační medium a způsoby kultivací. V této částí práce byly využívány extrakční, separační, analytické a biochemické metody. V části produkce lipas je charakterizován komerční přípravek SanyDuo Spezial (Sanytura GmbH), bakteriální kmeny, kultivační média a mnoho metod, jak biochemických, analytických, molekulárně biologických pro určení jeho vlastností. K této částí mám na autorku dotaz. Vzhledem k tomu, že v prácí se využívalo mnoho pracovních postupů a technik, jak na přípravu, tak na detekcí sledovaných ukazatelů, dle mého názoru není možné objektivně jak teoreticky tak ani prakticky zvládnout v průběhu standardní doby doktorského studia. Jaký má autorka podíl na provedených experimentech? Které experimenty prováděla sama? Kapitola výsledky a diskuse je poměrně rozsáhlá (40 stran). V první částí „Produkce polygalakturonas“ jako nejvhodnější kultivace kvasinkového mikroorganismus Geotrichum candidum na hroznových výliscích (zvlhčeným roztokem solí) se jevila SSF z hlediska zvýšené produkce polygalakturonas (PGas). Nejvyšší aktivity v průběhu 10. denní kultivace bylo dosaženo 3. a 7. den kultivace. Jak si autorka vysvětluje tento průběh (obr. 20) v průběhu celé doby kultivace? Na základě jakého zjištění došla autorka ke konstatování,“… je zřejmé, že se jedna o extracelulární polygalakturonasovou aktivitu“ v 3. a 7. den kultivace, když v závěru práce uvádí přítomnost jak endoPGasy tak i exoPGasy v hroznových výliscích? Předpokládaná přítomnost polygalakturonas byla potvrzena na základě pH optima, substrátové preference, teplotního optima, kinetických konstant. Existuje vztah, souvislost v případě tepelné stability a teplotního optima (obr. 23 a obr. 24)? Potvrzení PGas pomoci hmotnostní sprektrometrie, isoelektrického bodu a molekulové hmotnosti jednoznačně nepotvrdilo přítomnost sledovaných enzymů. V druhé částí výsledků a diskuse „Produkce lipas“ byl testován komerční přípravek (KP), u kterého byla potvrzena lipolytická aktivita. Míra lipolytické aktivity byla testována na modelových vzorcích odpadních vod, kde zdrojem uhlíku byly rostlinné oleje. U palmového oleje bylo dosaženo nejvyšší aktivity po 24 a 48 h kultivace, nejvyšší produkce uvolněných masných kyselin po 48h a i největší znečištění stanovením CHSK. Byly stanoveny i optimální teploty (25 oC a 50 oC) a pH (6 a 8) použitelností KP. Pomoci PCR metod byl identifikována mikroflóra komerčního přípravku – bakterie rodu Bacillus. Při navržení nového přípravku autorka se věnovala sledování vlivu pH, teploty a tenzidů na produkci lipas. Oceňuji použití 183 literárních zdrojů. V seznamu literatury nejsou uvedeny zákony, které autorka uvádí v textu. Doporučují používání správné a jednotné formy citací literárních odkazů v textu. Citace v textu se uvádí buď „autor a rok publikace“, nebo číselně. Autorka v textu uvádí jak autory, tak číselný odkaz. U některých literárních odkazů jsou uvedení jenom autoři (např. str. 18). V práci jsou některé formální nedostatky, které jsem vyznačila v práci. Závěry práce jsou formulované jasně. Lze konstatovat, že stanovené cíle byly splněny. Po prostudování předložené práce, i přes uvedené připomínky, mohu konstatovat, že práce odpovídá požadavkům kladeným na disertační práci. Teoretické i praktické zvládnutí dané problematiky, interpretace výsledků svědčí o vědeckých schopnostech autorky a o přenášení vědeckých poznatků do praxe. Vzhledem k výše uvedenému hodnocení doporučuji, aby disertační práce Ing. Kateřiny Illkové byla přijata k obhajobě a po její obhájení aby ji byl udělen vědecko-pedagogický titul Ph.D. ve studijním programu Chemie a technologie potravin.
eVSKP id 51133