Izolace a analýza DNA se zaměřením na mikroorganismy důležité v potravinářství

Abstract

Identifikace bakteriální DNA se skládá z několika kroků: lyze buněk, izolace a purifikace DNA, precipitace ethanolem a identifikace bakteriálního kmene pomocí PCR, případně i jiných molekulárně biologických metod. Každý krok musí být optimalizován. Nukleové kyseliny lze z buněk s výhodou izolovat pomocí magnetických nosičů. Molekuly DNA jsou na povrch magnetického nosiče navázány na základě elektrostatických interakcí a posléze jsou eluovány do pufru. Cílem práce bude optimalizace jednotlivých kroků identifikace bakteriální DNA: buněčná lyze, izolace DNA, charakterizace pevných magnetických nosičů funkcionalizovaných aminoskupinami pro izolaci nukleových kyselin. Přítomnost DNA v eluátu bude ověřena pomocí gelové agarosové elektroforézy a množství eluované DNA bude stanoveno spektrofotometricky. Kvalita izolované DNA bude bude ověřena její amplifikací s použitím polymerázové řetězové reakce (PCR). Dále je práce zaměřena na studium sekundárních struktur nukleových kyselin – křížových struktur a kvadruplexů. Tyto struktury se podílí na regulaci buněčných procesů a jejich výskyt je spojován s vývojem onkologických a neurodegenerativních onemocnění. Byla provedena analýza genomu in silico u mikroorganizmů významných v potravinářském průmyslu. Sevence genomů mikroorganismů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Pro analýzu byl použit software Palindrome Analyser a G4 Hunter.

Identification of bacterial DNA consists from several steps: cell lysis, isolation and purification of DNA, precipitation by ethanol, identification of bacterial strain by PCR or other molecular biology methods. Each step must be optimised. Nucleic acids can be isolated from cells using magnetic particles. The molecules of DNA are bound to the surface of magnetic carriers by electrostatic interaction, and then they are eluted into buffer. The aim of the work will be to optimize individual steps of identification of bacterial DNA: cell lysis, DNA isolation, characterization of solid magnetic carriers functionalized by amino groups for nucleic acids isolation. The presence of DNA will be verified using agarose gel electrophoresis and the amount of eluted DNA will be determined spectrophotometrically. The quality of isolated DNA will be proved by their amplification using polymerase chain reaction (PCR). Furthermore, the thesis focuses on the study of secondary structures of nucleic acids – cruciforms structures and quadruplexes. These structures are involved in the regulation of cellular processes and their appearance is associated with cancer development and neurodegenerative diseases. In silico genome analysis was performed on important food industry microorganisms. The microorganisms genomic sequences were obtained from the NCBI (National Center for Biotechnology) database. The Palindrome Analyzer and G4 Hunter software were used for the analysis.