Využití vybraných molekulárních metod k metabolické charakterizaci průmyslově významných kvasinek
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
P
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Karotenoidy, ergosterol a mastné kyseliny jsou velmi žádané látky využívané v krmivářském, potravinářském a kosmetickém průmyslu. Konvenční zdroje mastných kyselin a karotenoidů jsou závislé na sezónních podmínkách, geografické poloze a na dostupnosti zemědělské půdy, což znesnadňuje pokrýt jejich neustále se zvyšující spotřebu. Velmi slibným řešením je mikrobiální produkce výše uvedených látek pomocí karotenogenních kvasinek, které jsou schopny simultánně produkovat karotenoidy, mastné kyseliny i ergosterol. Předložená disertační práce je zaměřená na molekulární a metabolickou charakterizaci karotenogenních kvasinek a na jejich potenciál pro průmyslové aplikace. Proto první experimentální části práce jsou zaměřeny na kvasinky druhu R. mucilaginosa a R. toruloides, jejich produkční vlastnosti, vliv nutričního stresu a různých zdrojů uhlíku, jakými byly xylóza a glycerol. Kromě podrobné charakterizace jejich produkčních vlastností, byly tyto kmeny také charakterizovány molekulárními metodami, zahrnující sekvenční analýzu ITS1, ITS2 a D1/2 ribozomálního operonu a analýzu mini a mikrosatelitních sekvencí M13 a GTG5. Druh R. toruloides je známý jako vynikající producent mastných kyselin, a proto se v poslední době stal cílovou karotenogenní kvasinkou pro vývoj nástrojů pro jeho genetickou manipulaci. V této práci byly úspěšně připraveny geneticky modifikované klony kmene R. toruloides, nesoucí nadměrně exprimované geny pro diacylglycerol acyltransferázu (DGA1) a glycerol-3-fosfát dehydrogenázu (GPD1). Produkce mastných kyselin u modifikovaných klonů nebyla ve srovnání s původním kmenem vyšší. Proto byla další část práce zaměřená na přípravu nadprodukčních mutantních kmenů připravených náhodnou mutagenezí. Kombinace limitace dusíkem a inhibice produkce karotenoidů vedla k úspěšné selekci robustních mutantních kmenů s nadprodukcí karotenoidů vykazující rezistenci vůči difenylaminu. Poslední část práce se zabývá produkčními vlastnostmi méně známých druhů karotenogenních kvasinek náležící do řádů Sporidiobolales a Cystofilobasidales, ve srovnání s relativně dobře prostudovanými karotenogenními druhy R. toruloides a P.rhodozyma. V této studii byly nejlešími producenty mastných kyselin kmeny S.metaroseus CCY 19-6-20 a C. macerans CCY 10-01-02. Nejlepší producent karotenoidů, kmen R. mucilaginosa CCY 19-04-06, navíc produkoval lykopen, který představoval více než 80 % celkového množství karotenoidů produkovaných tímto kmenem.
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
Description
Keywords
Karotenogenní kvasinky, karotenoidy, ergosterol, mastné kyseliny, genetická modifikace, náhodná mutageneze, Sporidiobolales, Cystofilobasidiales, Rhodotorula, Sporobolomyces, difenylamin, EMS, MMS, UV-C, Carotenogenic yeasts, carotenoids, ergosterol, fatty acids, genetic modification, random mutagenesis, Sporidiobolales, Cystofilobasidiales, Rhodotorula, Sporobolomyces, diphenylamine, EMS, MMS, UV-C
Citation
KOSTOVOVÁ, I. Využití vybraných molekulárních metod k metabolické charakterizaci průmyslově významných kvasinek [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2021.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
en
Study field
Potravinářská chemie
Comittee
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (předseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc. (člen)
prof. Ing. Stanislav Kráčmar, DrSc. (člen)
Date of acceptance
2021-05-14
Defence
Z důvodu nouzového stavu proběhla obhajoba Ing. Ivety Kostovové kombinovaným způsobem - doktorandka, většina fakultních členů komise a školitel (který není členem komise) byli přítomni při obhajobě prezenčně a mimofakultní členové komise byli připojeni formou videokonference. Průběh obhajoby byl nahráván. Hlasování proběhlo tajně online formou. Předseda komise představil doktorandku. Ing. Kostovová v roce 2012 absolvovala odbornou stáž v Dolní Dobrouči a dále pobyty v rámci progranu Erasmus - stáž v Institutu Micalis, Francie a na univerzitě v Grazu, Rakousko. Doktorandka má jeden užitý vzor, je spoluautorkou tří publikací v časopisech a několika konferenčních příspěvků. Ve své powerpointové prezentaci představila doktorandka výsledky své práce. Byly přečteny oponentské posudky, oba kladné a doporučovaly práci k obhajobě. Posudky obsahovaly dotazy, doktorandka na ně uspokojivě odpověděla. Dotazy členů komise vzešlé z následné diskuzi byly také dobře zodpovězeny. Dotazy fyzicky přítomných členů komise jsou uvedeny na přiložených dotazních lístcích, které se archivují.
Práce s názvem "Využití vybraných molekulárních metod k metabolické charakterizaci průmyslově významných kvasinek" je kvalitně jak obsahově, tak formálně zpracovaná a vyvážená a je napsána v angličtině. Závěry dizertační práce jsou správně interpretovány a mohou sloužit pro další zkoumání problematiky v oblasti teorie a praxe. Některý z dotazů: Pro jaký druh živočichů (přežvýkavá vs. nepřežvýkavá) byste využila poznatky z vaší práce?
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení