Využití techniky DGGE k analýze a identifikaci vybraných druhů mikroorganismů
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Predložená diplomová práca je zameraná na využitie techniky DGGE v analýze a identifikácii vybraných druhov mikroorganizmov. PCR-DGGE je metódou, ktorá umožňuje priamu charakterizáciu mikrobiálneho spoločenstva v prirodzenom prostredí, tzn. bez potreby kultivácie. Literárny prehľad sa venuje princípu metódy, súčasným aplikáciam i limitačným faktorom. V experimentálnej časti práce bola izolovaná mikrobiálna DNA, ktorá bola použitá ako templát pre reakciu PCR. S použitím univerzálnych eukaryotických primerov bola amplifikovaná D1/D2 oblasť 26S rDNA. Zvolená bola modifikácia PCR využívajúca vonkajší a vnútorný pár primerov – nested PCR vyznačujúca sa vyššou citlivosťou a špecifitou. Získané amplikóny (asi 250 bp) boli ďalej separované technikou DGGE. Vlastná analýza vybraných mikrobiálnych druhov metódou DGGE bola uskutočnená po optimalizácii základných parametrov (predovšetkým rozsah denaturačného gradientu a celkový čas separácie). Vzájomné rozlíšenie medzi jednotlivými druhmi kvasiniek napriek optimalizácii nebolo možné, keďže každý referenčný druh bol reprezentovaný niekoľkými fragmentmi DNA v tých istých pozíciach. V závere práce je diskutovaný DGGE profil získaný z reálnych vzoriek muštu vínnej révy. Prítomné zóny naznačujú prítomnosť predovšetkým apikulátnych kvasiniek, v malej miere kvasinkového mikroorganizmu A. pullulans a pravdepodobne sacharomycétnych kvasiniek. Technika ostáva otvorená ďalšej optimalizácii, najmä čo sa týka podmienok polymerázovej reťazovej reakcie.
Presented diploma thesis is focused on use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms. PCR-DGGE is a method that allows direct characterization of the microbial community in the natural environment without necessity of cultivation. A literature review is devoted to the principle of the method, current applications and its limitations too. In experimental part microbial DNA was isolated and used as a template for PCR reaction. Microbial DNA was then amplified using the universal eukaryotic primers that target the D1/D2 domain of the 26S subunit of ribosomal DNA. To improve specificity and sensitivity of detection nested PCR was chosen using outer and inner primer pairs. Generated amplicons (250 bp) were consequently separated by DGGE. The analysis of selected microorganisms by DGGE technique was performed after optimization of electrophoresis conditions (in particular the denaturing gradient extent and separation time). Despite the optimization, mutual differentiation among individual yeast strains was not possible since each reference strain was represented by several bands in the same positions. In conclusion DGGE profile obtained from wine musts is discussed. Present bands suggest the major presence of non-Saccharomyces yeasts, yeast-like strain A. pullulans is present in the minority and Saccharomyces yeasts are probably present too. The technique remains open for further optimization, particularly as regards the conditions of polymerase chain reaction.
Presented diploma thesis is focused on use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms. PCR-DGGE is a method that allows direct characterization of the microbial community in the natural environment without necessity of cultivation. A literature review is devoted to the principle of the method, current applications and its limitations too. In experimental part microbial DNA was isolated and used as a template for PCR reaction. Microbial DNA was then amplified using the universal eukaryotic primers that target the D1/D2 domain of the 26S subunit of ribosomal DNA. To improve specificity and sensitivity of detection nested PCR was chosen using outer and inner primer pairs. Generated amplicons (250 bp) were consequently separated by DGGE. The analysis of selected microorganisms by DGGE technique was performed after optimization of electrophoresis conditions (in particular the denaturing gradient extent and separation time). Despite the optimization, mutual differentiation among individual yeast strains was not possible since each reference strain was represented by several bands in the same positions. In conclusion DGGE profile obtained from wine musts is discussed. Present bands suggest the major presence of non-Saccharomyces yeasts, yeast-like strain A. pullulans is present in the minority and Saccharomyces yeasts are probably present too. The technique remains open for further optimization, particularly as regards the conditions of polymerase chain reaction.
Description
Citation
JANKEJE, K. Využití techniky DGGE k analýze a identifikaci vybraných druhů mikroorganismů [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2011.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
sk
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. Ing. Peter Šimko, DrSc. (předseda)
doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. (místopředseda)
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (člen)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (člen)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
Date of acceptance
2011-06-06
Defence
1. Diplomantka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce.
2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.
3. Diplomantka akceptovala všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděla v plné šíři.
4. Diskuse:
doc. Španová poznámky k terminologii.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení