Vícerozměrné separace v kapalné fázi

Abstract

Dizertační práce se zabývá problematikou vícerozměrných separací v kapalné fázi. Tyto separační techniky jsou vyvíjeny ve snaze splnit současné požadavky kladené na analýzu velmi složitých vzorků, jejichž komponenty jsou teplotně nestálé, mají nízkou tenzi par nebo vysokou molekulovou hmotnost a nelze je analyzovat s využitím dvourozměrné (2D) plynové chromatografie. V teoretické části práce jsou vysvětleny koncepty píkové kapacity a ortogonality. Vysokoúčinná kolonová kapalinová chromatografie (HPLC) a vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) jsou zde chápány jako nejvhodnější jednorozměrné kapalinově-separační techniky pro realizaci vícerozměrných separací v kapalné fázi, jelikož s nimi lze realizovat automatizované provedení vícerozměrné separace navíc s možností on-line spojení s hmotnostní spektrometrií. V experimentální části je popsána konstrukce zjednodušeného miniaturizovaného kapalinového chromatografu. Původní koncept byl rozšířen o možnosti přípravy gradientů mobilní fáze. Funkce systému byla demonstrována na gradientové separaci směsi alkylfenonů, peptidů z tryptického digestu BSA a směsí nitrolátek. Popsaný LC systém byl použit jako základ několika dvourozměrných separačních platforem. Realizována byla HILIC-MALDI-MS analýza glykanů, dvourozměrná separace peptidů z tryptického digestu BSA využívající off-line spojení kapilární izoelektrické fokusace s vyvinutým gradientovým miniaturizovaným LC systémem a platforma umožňující realizaci on-line dvourozměrné kapalinové chromatografie v módech IEC×RPLC, RPLC×RPLC a HILIC×RPLC. Prezentované výsledky podporují správnost uvažovaného konceptu.

This dissertation is dedicated to the topic of multidimensional liquid phase separations. This separation techniques are developed for analysis of complex samples containing thermally labile, low volatile or high molecular weight components that can´t be analysed by two-dimensional (2D) gas chromatography. Concepts of peak capacity and orthogonality are explained and various methods of their determination are stated in theoretical part of dissertation. High performance column liquid chromatography (HPLC) and high performance capillary electrophoresis (HPCE) are suggested as the most suitable methods for automated multidimensional liquid phase separations on-line coupled to mass spectrometry. Configuration of simplified miniaturized liquid chromatograph is described in experimental part of this thesis. Original concept of the system has been extended by simple mobile phase gradient generation technique. Correct function was demonstrated on repeatable separation of alkylphenones, peptides, nitroaromatics, and nitroesters. This system has been utilized as a base for a couple of simple two-dimensional separation platforms for HILIC-MALDI-MS analysis of glycans, for separation of peptides based on off-line coupling of isoelectric focusing and capillary liquid chromatography, and finally for on-line IEC×RPLC, RPLC×RPLC, and HILIC×RPLC two-dimensional liquid chromatography. Correct operation of submitted platforms has been proved.