Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
S rozvojem molekulárně biologických metod se zvyšuje zájem o nové postupy izolace DNA o vysoké kvalitě. Izolace DNA se provádí z hrubých lyzátů buněk mnoha technikami např. fenolovou extrakcí, vysolováním nebo adsorpcí na pevnou fázi. Klasická izolace DNA, jakou je fenolová extrakce je poměrně složitá a časově náročná. Z toho důvodu byly vyvinuty nové alternativní metody izolace DNA využívající reverzní imobilizaci DNA na pevnou fázi. Velmi rozšířené je používání magnetických nosičů, které umožňují izolovat DNA ve vysoké kvalitě přímo z hrubých lyzátů buněk komplexních vzorků. Současná metoda adsorpce DNA na povrch magnetických částic neposkytuje v některých případech při analýze komplexních vzorků (např. potravin) dostatečně čistou DNA. Část inhibitorů polymerázové řetězové reakce (PCR) se zřejmě adsorbuje na stěny zkumavky, při eluci DNA dochází k jejich uvolnění do roztoku a následnému ovlivnění kvality DNA (např. snížení citlivosti amplifikace v PCR). Principem vyvíjeného postupu je konstrukce zařízení, které využívá přenos magnetických částic paramagnetickou jehlou z jedné Eppendorfovy zkumavky do druhé, ve které probíhá další zpracování vzorku. Přenosem pomocí jehly se zabraňuje přenosu kontaminujících nečistot. Navržené zařízení umožňuje realizovat výše uvedený postup. Funkčnost zařízení byla ověřena při izolaci plasmidové pUC19 DNA z hrubých lyzátů buněk E. Coli JM 109 (pUC19).
With a development of molecular biology methods it is an increasing interest in new procedures of DNA isolation of high quality. DNA isolation is performed on crude cell lysates by many techniques e.g. phenol extraction, salting out or adsorption on solid phase. Classical DNA isolation, such as phenol extraction is quite complicated and time consuming. New alternative methods of DNA isolation was development using reverse immobilizing DNA to a solid phase. Widespread is the use of the magnetic particles as carriers, which allow the isolation of DNA in high quality directly from crude cells lysates of complex samples. The current method of DNA adsorption onto the surface of magnetic particles does not provided sufficiently pure DNA for analysis of some comlex samples (e.g. food). Some inhibitors of the polymerase chain reaction (PCR) are apparently adsorbed onto the tube wall and the next step of DNA elution leads to their release into the solution and cpnsequent negative effect on quality of DNA (e.g. decreasing of PCR amplification). The principle of the developed procedure is design a device, which utilizes transfer of magnetic particles by paramagnetic newddle from one to another Eppendorf tube, in which further processing of the sample extends. Transfer of magnetic particles with DNA using needle prevents transmission of contaminating impurities. The proposed device allows to realize above-mentioned procedure. The functionality of the device being tested in the isolation of plasmid pUC19 DNA from crude lysates of E. Coli JM 109 (pUC19).
With a development of molecular biology methods it is an increasing interest in new procedures of DNA isolation of high quality. DNA isolation is performed on crude cell lysates by many techniques e.g. phenol extraction, salting out or adsorption on solid phase. Classical DNA isolation, such as phenol extraction is quite complicated and time consuming. New alternative methods of DNA isolation was development using reverse immobilizing DNA to a solid phase. Widespread is the use of the magnetic particles as carriers, which allow the isolation of DNA in high quality directly from crude cells lysates of complex samples. The current method of DNA adsorption onto the surface of magnetic particles does not provided sufficiently pure DNA for analysis of some comlex samples (e.g. food). Some inhibitors of the polymerase chain reaction (PCR) are apparently adsorbed onto the tube wall and the next step of DNA elution leads to their release into the solution and cpnsequent negative effect on quality of DNA (e.g. decreasing of PCR amplification). The principle of the developed procedure is design a device, which utilizes transfer of magnetic particles by paramagnetic newddle from one to another Eppendorf tube, in which further processing of the sample extends. Transfer of magnetic particles with DNA using needle prevents transmission of contaminating impurities. The proposed device allows to realize above-mentioned procedure. The functionality of the device being tested in the isolation of plasmid pUC19 DNA from crude lysates of E. Coli JM 109 (pUC19).
Description
Citation
NĚMEČEK, M. Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2017.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (místopředseda)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2017-05-30
Defence
1. Diplomant seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce.
2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.
3. Diplomant akceptoval všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděl v plné šíři.
Diskuse
prof. Márová: Bude patentováno ?
doc. Obruča: Existuje podobný komerčně dostupný přístroj ?
doc. Diviš: Výtěžnost metody ?
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení