Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
Recombinant proteins belong to considerable biofarmaceutics products used in biomedical research and in the treatment of human disease. Recombinant protines can be produced by stable transfection in big amount or by faster transient transfection with smaller amounts. To provide regular biological activity, it is necessary for the protein to be properly folded and post-translationally modified. As these modifications can be accurately performed only in mammalian cells, they have become the major host for complex r-protein expression. In this thesis is described transient transfection HEK 293 EBNA1 cells with linear polyethylenimines. These cells has been adapted to suspension cultivation in serum free medium. The cells were transfected with pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO plasmids, everyone contained repoter gene SEAP. Concentration of SEAP in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. DNA:PEI ratio was another factor which was optimised and two different PEIs were compared. Highest achieved expresion was 50 mg per litre with transfection in 24 well plate when DNA:PEI ratio was 1:5. Comparison of six different plasmids give the bigest expresion pCEP4/SEAP, in well plate as well as in scaled up system.
Recombinant proteins belong to considerable biofarmaceutics products used in biomedical research and in the treatment of human disease. Recombinant protines can be produced by stable transfection in big amount or by faster transient transfection with smaller amounts. To provide regular biological activity, it is necessary for the protein to be properly folded and post-translationally modified. As these modifications can be accurately performed only in mammalian cells, they have become the major host for complex r-protein expression. In this thesis is described transient transfection HEK 293 EBNA1 cells with linear polyethylenimines. These cells has been adapted to suspension cultivation in serum free medium. The cells were transfected with pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO plasmids, everyone contained repoter gene SEAP. Concentration of SEAP in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. DNA:PEI ratio was another factor which was optimised and two different PEIs were compared. Highest achieved expresion was 50 mg per litre with transfection in 24 well plate when DNA:PEI ratio was 1:5. Comparison of six different plasmids give the bigest expresion pCEP4/SEAP, in well plate as well as in scaled up system.
Description
Citation
ŠMÍD, J. Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1 [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2009.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. Ing. Peter Šimko, DrSc. (předseda)
doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. (místopředseda)
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (člen)
prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc. (člen)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (člen)
Date of acceptance
2009-06-08
Defence
1. Diplomant seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce.
2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.
3. Diplomant akceptoval všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděl v plné šíři.
4. Diskuse:
doc. Márová: Jaký objem měly lahve?
doc. Omelková: Nesmrtelné linie lidských buněk - jakým způsobem byly buňky upraveny?
doc. Márová: Jak bylo upraveno médium?
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení