Show simple item record

Use of Molecular Biology Techniques for Identification and Analysis of Probiotic Bacteria

dc.contributor.advisorObruča, Stanislavcs
dc.contributor.authorKonečná, Janacs
dc.date.accessioned2019-06-14T11:45:41Z
dc.date.available2019-06-14T11:45:41Z
dc.date.created2019cs
dc.identifier.citationKONEČNÁ, J. Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.cs
dc.identifier.other120310cs
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11012/178205
dc.description.abstractIzolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.cs
dc.description.abstractIsolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.en
dc.language.isocscs
dc.publisherVysoké učení technické v Brně. Fakulta chemickács
dc.rightsStandardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezenícs
dc.subjectLactobacilluscs
dc.subjectMagnetické částicecs
dc.subjectExtrakce na pevné fázics
dc.subjectIzolace deoxyribonukleové kyselinycs
dc.subjectPolymerázová řetězová reakcecs
dc.subjectVysokorozlišovací analýza křivek tánícs
dc.subjectLactobacillusen
dc.subjectMagnetic particlesen
dc.subjectSolid-phase extractionen
dc.subjectDeoxyribonucleic acid isolationen
dc.subjectPolymerase chain reactionen
dc.subjectHigh-Resolution Melting Analysisen
dc.titleVyužití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakteriícs
dc.title.alternativeUse of Molecular Biology Techniques for Identification and Analysis of Probiotic Bacteriaen
dc.typeTextcs
dcterms.dateAccepted2019-05-22cs
dcterms.modified2019-05-22-17:50:20cs
thesis.disciplinePotravinářská chemiecs
thesis.grantorVysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. Ústav chemie potravin a biotechnologiícs
thesis.levelDoktorskýcs
thesis.namePh.D.cs
sync.item.dbid120310en
sync.item.dbtypeZPen
sync.item.insts2019.06.14 13:45:41en
sync.item.modts2019.05.22 20:25:34en
dc.contributor.refereeDoškař, Jiřícs
dc.contributor.refereeKráčmar, Stanislavcs
dc.description.markPcs
dc.type.driverdoctoralThesisen
dc.type.evskpdizertační prácecs


Files in this item

Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record