SKOUPÝ, R. 3D rekonstrukce makromolekulárních komplexů pomocí kryoelektronové mikroskopie [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií. 2016.
Radim Skoupý aktivně přistupoval k řešení zadané diplomové práce. V jejím průběhu se seznámil s principy formování obrazu v transmisním elektronovém mikroskopu, přípravy kryoEM vzorků a zpracování datasetů pro 3D tomografii a single particle analysis na výpočetních klastrech za použití speciálních programových balíků Relion a Bsoft. Student úspěšně určil počáteční 3D model struktury komplexu EcoR124I pomocí kryo-elektronové tomografie a průměrováním orientovaných jednotlivých 3D molekul extrahovaných z rekonstruovaných 3D tomogramů. Dále student pokročoval ve zpracování datasetů pro určení struktury EcoR124I do vysokého rozlišení, kde se soustředil na optimalizaci algoritmů pro automatický sběr jednotlivých molekul ze stovek naměřených mikrografů. Samostatně navrhl přístup s použitím waveletového filtru, který potlačuje šum účinněji než standardně používaný bandpass filtr. Navržený postup aplikoval na několik různých datasetů naměřených pomocí různých elektronových mikroskopů a technik. Optimalizovaný algoritmus použil pro extrakci ~10,000 částic a pokračoval v jejich zpracování pomocí 2D orientace a klasifikace. Dosažené výsledky poskytují základ pro 3D rekonstrukci komplexu EcoR124I v otevřené konformaci, jejichž zpracování budou dokončeny v blízké době. Diplomovou práci student vypracoval samostatně, kdy čerpal z našich společných konzultací a doporučené literatury. Diplomová práce dobře ukazuje postup ve zpracování datasetů z kryo-elektronové mikroskopie a tomografie a teoreticky podkládá přístup ve zpracování naměřených mikrografů a jejich filtrování pomocí waveletového filtru. Navržený postup umožnil automatické sbírání jednotlivých molekul z mikrografů, nicméně kvantitativní analýza zlepšení výběru částic (procento false positives) s použitím waveletového filteru ve srovnání s běžným bandpass filterem nebyla provedena. Po formální stránce je práce rozdělena do pěti sekcí, kdy po obecném úvodu je popsána technika kryoelektronové mikroskopie biologických vzorků (kapitola 2) a problematika restrikčních endonukleáz (kapitola 3). Kapitola 4 se zabývá technikou kryo-elektronové tomografie a reportuje konstrukci počátečního modelu komplexu EcoR124I. V páté kapitole jsou popsány počáteční kroky pro 3D rekonstrukci biologických komplexů pomocí metod single particle analysis. Tato část se hlavně soustředí na identifikaci jednotlivých částic v mikrografech, jejich extrakci a 2D klasifikaci analýzu. I když nebylo během práce dosaženo 3D rekonstrukce komplexu, kritické kroky ve zpracování naměřených dat byly optimalizovány a rekonstrukce bude dopočítána v blízké době. Diplomovou práci doporučuji k obhajobě s hodnocením výborně (A).
Předložená diplomová práce se zabývá problematikou kryogenní elektronové mikroskopie, elektronové tomografie a obrazovou analýzou experimentálních dat, které byly získány na testovacím objektu, restrikční endonukleáze EcoR124I. V úvodu se autor věnuje popisu metody transmisní kryogenní elektronové mikroskopie, přípravě vzorku a tvorbě obrazu v elektronovém mikroskopu. Přestože je text psán srozumitelnou formou, v kapitole 2.1.2. se autor, dle mého názoru, dopustil nepřesností v popisu tvorby fázového kontrastu (viz. otázka č. 1). Po části věnované popisu funkce a struktury vybraného testovacího proteinového komplexu, restrikční endonukleázy EcoR124I, následuje první díl praktické části týkající se izolace restrikční endonukleázy, přípravy vzorku pro elektronový mikroskop a snímkování vzorku. V této části mám výhrady k prezentaci obrázků, které by si zasloužily od autora více pozornosti. Jmenovitě obrázek 3.3, kde v popisu obrázku zcela chybí popis SDS-PAGE experimentu, označení os u záznamu chromatogramu a dále popis použitých zkratek. Prezentace obrázku 3.4 formou „print-screen“ je dle mého názoru u diplomové práce také nevyhovující. V navazující části se autor věnuje teoretickému popisu metody elektronové tomografie a prezentuje výsledek její aplikace na získání počátečního 3D modelu studovaného proteinu. Získaný model sloužil jako reference pro automatické vyhledávání projekcí z kryogenních snímků pro jednočásticovou analýzu. V praktické části kapitoly jednočásticové analýzy se autor detailně věnuje výběru optimálního filtru originálních snímků pro potlačení šumu a zvýšení kontrastu projekcí studovaného proteinu. Autor této části věnoval zvýšenou pozornost, nad rámec zadaní diplomové práce, což lze hodnotit kladně. Po korekci přenosové funkce kontrastu byly vybrané projekce studovaného proteinu podrobeny obrazové analýze, jejímž výsledkem byla 2D klasifikace projekcí do homogenních skupin, které jsou výchozí pro 3D rekonstrukci. K tomuto kroku se však autor již nedostal, přestože to byl hlavní úkol v zadání práce. Autor tuto skutečnost v práci nijak nekomentuje, ani neuvádí žádné důvody, proč cíle práce nedosáhl. Po formální stránce bych uvítal klasické členění práce na teoretický úvod, popis použitých materiálů a metod, část výsledky, diskuze a závěr. Opakovaná kombinace teoretických a experimentálních částí zhoršuje dle mého názoru orientaci v textu. V experimentálních částech práce se autor věnuje pouze popisu výsledků, diskuzi obdržených výsledků opomíjí. Po jazykové stránce je práce, až na drobné výjimky, v pořádku. Kvůli výše uvedeným nedostatkům navrhuji hodnocení diplomové práce stupněm C, 75 bodů.
eVSKP id 84445