TRČKOVÁ, M. Využití metody LC/MS k analýze vybraných přírodních fyziologicky aktivních látek [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2008.

Posudek vedoucího

Kočí, Radka

Předložená práce Bc. Marie Trčkové je zaměřena na využití kombinované instrumentální techniky LC/MS k analýze vybraných fyziologických komponent izolovaných z komplexní biologické matrice. Diplomatka během práce prokázala výbornou orientaci v odborné literatuře i účelové využití poskytnutých informací. Z praktického hlediska byla studentka schopná samostatně a poměrně rychle zvládnout instrumentálně složitou techniku HPLC s on-line i off-line hmotnostní detekcí a optimalizovat podmínky pro izolaci a stanovení vybraných skupin aktivních látek v lidském organismu.Vzhledem k velkému počtu naměřených dat bylo vyhodnocení poměrně obtížné a časově náročné, ale velmi odceňuji komentář výsledků a rozsáhlou diskuzi včetně využití literárních zdrojů. Celkově lze konstatovat, že diplomantka přistupovala k práci zodpovědně a svědomitě, po celou dobu řešení se aktivně zajímala o danou prolematiku a samostatně řešila dílčí úkoly. Získané vědomosti jistě uplatní při dalším studiu nebo v praxi.

Posudek oponenta

Čáslavský, Josef

Předložení diplomová práce je zaměřena na zajímavou, ale poměrně obtížnou problematiku analýzy flavonoidů a karotenoidů v potravinách - ovoci, zelenině a některých dalších. Práce o rozsahu 92 stran textu je doplněna seznamem použitých zdrojů čítajícím 68 položek, dále seznamem použitých zkratek a symbolů a 28 přílohami. Rozsah tedy odpovídá účelu práce. Práce jako celek je sestavena poměrně pečlivě, obsahuje však poměrně dost neopravených překlepů. Formálním nedostatkem je nízká kvalita některých obrázků (např. obr. 18 je takřka nečitelný), popis k obr. 13 odskočil od příslušného obrázku na počátek další stránky, obdobný jev v opačném provedení je v přílohách na str. 110. K teoretické části mám následující věcné připomínky a komentáře: Str. 10 - kapalinová chromatografie s MS detekcí - MS rozezná jen ty látky, které se podaří úspěšně ionizovat. Metody mají být instrumentální, ne instrumentační. Str. 11 - má být "adsorpce", ne adsorbce, "chemisorpce", ne chemisorbce, "sítový efekt", ne síťový Str. 13 - tvrzení o žhaveném křemenném vlákně u SPME je nesprávné; rozmezí velikosti částic používaných jako náplně kolon v HPLC je zastaralé (dnes se používají částice od 1,5 um); současná čerpadla v HPLC jsou schopna práce ne do 50, ale do 100 MPa. Str. 15 - kolonové uspořádání se v plynové chromatografii nepoužívá nejčastěji, ale výhradně; co je míněno pojmem "jednorázový nástřik na kolonu"? Adsorbenty v žádném případě nejsou zakotveny na neaktivním nosiči. Kapilární kolony pro plynovou chromatografii jsou dnes takřka výhradně křemenné, potažené vrstvou polylimidu. Jak by mohla fungovat kolona vyplněná v celém objemu stacionární fází? Kolony typu SCOT se dnes již nepoužívají. Vzorek i u náplňových kolon se může dávkovat přímo do kolony, autorka nezmínila základní typ dávkování pro kapilární kolony - split/splitless. Str. 16 - spojení "tepelně vodivostní katarometr" je nesmyslné. Kap. 2.1.3.2 velice vágně specifikuje oblasti využití plynové chromatografie; nezmiňuje se její hlavní výhoda - podstatně vyšší separační účinnost v porovnání s kapalinovou chromatografií. Opravdu je u kapilární zónové elektroforézy objem vzorku v řádu µl ? Jak lze touto technikou separovat nenabité sloučeniny? Str. 17. kap. 2.1.5.2: Správné názvy technik jsou: elektronová ionizace, hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů, bombardování rychlými atomy. MALDI je desorpce/ionizace laserem za účasti matrice. Kromě toho MALDI a SIMS i FAB se využívají pro pevné vzorky. Str. 18, Tvrdé ionizační techniky - tvrzení o nemožnosti nalezení molekulárního iontu ve spektru je nesprávné. Naopak technika MALDI rozhodně neprodukuje velmi mnoho fragmentů. Jaké jsou mechanické způsoby separace iontů od neutrálních molekul? Str. 19 - u elektrospreje není zmíněn pomocný zmlžovací mechanismus, ionty v elektrospreji nevznikají. Elektrosprej nebyl vynalezen roku 1984 Yamashitou a Fennem. Str. 20 - popis obrázku 4 - položka - "rozprašovač plynu" - jak může být plyn rozprašován? Pro "rozprašovač" se používá termín "zmlžovač". Jehla u APCI není koronární, ale koronová. Str. 21 - UV lampa u APPI neprodukuje elektrony, ale fotony, které pak ionizují analyty. Odst. 2.1.5.3 - symbol "n" u zkratky "MSn" neznamená počet nabití vybraného iontu, ale počet stupňů v tandemové hmotnostní spektrometrii. Magnetický analyzátor nemá vysoké rozlišení. Str. 22 - namísto termínu "iontová past" by mělo být použito "sférická iontová past", neboť dnes jsou i iontové pasti lineární. Popis procesu ionizace v pasti se týká 1. generace těchto zařízení, dnes se již výhradně produkují systémy s externí ionizací (do této kategorie spadá i přístroj, který diplomantka využívala v rámci experimentální práce). Str. 25 - autorkou uváděné údaje ohledně spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií mají historický význam, dnes se výhradně používá přímé spojení. Str. 26 nano-ESI se používá spíše pro spojení kapilární kapalinové chromatografie s MS, případně v off-line verzi při malých objemech vzorku. Str. 27 - překvapuje mne tvrzení, že LC/MS se používá v environmentální analýze pro stanovení nejrůznějších těkavých a polárních polutantů. Odst. 2.1.7.2 - opravdu je GC/MS vhodná pro analýzu oligosacharidů? Str.35 - termín "mateřský ion" se nepoužívá, byl nahrazen výrazem "prekursor" Str. 36 - uvedené štěpení je "Retro-Diels-Alderovo" V kapitolách Experimentální část a Výsledky a diskuse je prezentováno značení množství experimentálních dat, která diplomantka v rámci této práce vyprodukovala, od ladění hmotnostního spektrometru přes optimalizace postupu izolace sledovaných látek se studovaných matric až po kvantitativní údaje. Tato data jsou přehledně a systematicky uspořádána v tabelární i grafické podobě. K experimentální části mám následující připomínky: Xcalibur je chybě označen jako integrátor. Zařízení označené autorkou jako "syringe pumpa" se zpravidla v češtině nazývá lineární dávkovač. K části Diskuse a výsledky pak mám následující komentáře: Kap. 4.3: Jaký rozdíl vidí autorka mezi on-line a off-line separací? Poznámka k závěru kap. 4.3.2: Porovnávání koeluce v off-line uspořádání a on-line uspořádání není relevantní vzhledem k rozdílné koncepci obou metod. V on-line uspořádání pak není úplná chromatografická separace podmínkou, pokud koeluující látky mají v hmotnostním spektru rozdílné ionty. Seznam použitých zdrojů je formátován poměrně nepřehledně - lepší by bylo předsazení prvního řádku a odsazení čísla citace od textu. První citace je nedokončená a s chybou. Nakladatelství Karlovy university se jmenuje Karolinum, ne Karolinium (cit. 20, 27). Dále jsou zde nejednotně psána velká písmena v názvech zahraničních periodik. Vyskytuje se zde poměrně hojně překlepů (např. cit. 25, 26), není dodržováno pravidlo o mezerách za interpunkčními znaménky. V seznamu použitých zkratek a symbolů je dvakrát plynová chromatografie - GC. Doporučení k LC/MS záznamům - u spekter z on-line spojení LC/MS je většinou vhodné zprůměrovat spektra přes celý chromatografický pík a případně ještě odečíst pozadí - kvalita spektra se tím ve většině případů významně zlepší. V interpretovaných produktových spektrech je zvykem uvádět struktury jednotlivých fragmentů, nikoliv jen šipkami označit příslušné fragmentové píky

eVSKP id 2632