Příprava myších monoklonálních protilátek proti cyklin-dependentní kináze 13
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
B
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Cieľom mojej diplomovej práce bola príprava monoklonálnej protilátky proti cyklin-dependetnej kináze 13 (CDK13). V teoretickej práci som sa zameral na väzbu antigén – protilátka, ktorá je podstatná práve pri využití monoklonálnych protilátok pri stanovení CDK13, ako aj transkripcii, ktorú táto kináza ovplyvňuje. Rovnako som sa venoval metódam Western blot a ELISA, na ktorých som založil detekciu novo vzniknutých protilátok. V teoretickej časti som následne zmienil aj protilátky a definíciu antigénu, na ktorú som nadviazal svoje výsledky v diskusii. V praktickej časti som sa venoval príprave antigénu – jeho izolácii a purifikácii na peristaltickej pumpe. Ďalej som sa venoval imunizácii, jej priebehu a množstvu antigénu použitého na imunizáciu myší. Po imunizácii sa zameriavam na fúziu buniek sp-2 a splenocytov, ktoré bolo najskôr treba odobrať z imunizovanej myši a prečistiť. Po samotnej fúzii zmieňujem selekciu hybridomovna selekčnom média HAT a následne ich detekciu najskôr pomocou metódy ELISA a neskôr pomocou metódy Western blot. Vzniknuté hybridomy s pozitívnou odozvou pri metóde ELISA boli zamrazené na ďalšie testovanie na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brne, kde bola spravená celá praktická časť diplomovej práce. Tieto zamrazené hybridomy budú v ďalšom výskume testované imunoprecipitáciou, ktorou je táto diplomová práca zakončená.
The aim of this master‘s thesis is to prepare a monoclonal antibody against cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). The theoretical part focuses on antigen-antibody binding, which is essential for the use of monoclonal antibodies in the determination of CDK13 as well as the transcription that this kinase affects. This section is also devoted to Western blot and ELISA methods for detection of newly generated antibodies. Furthermore, the antibodies and the antigen definition are stated, which are later on discussed. The practical part is devoted to the preparation of antigen - its isolation and purification on a peristaltic pump. It also addresses immunization, its course, and the amount of antigen used to immunize mice. After immunization, the work focuses on fusion of sp-2 cells and splenocytes, which were first removed from the immunized mouse and purified. After the fusion alone, selection of hybridomas on HAT selection medium is mentioned, followed by detection first by ELISA and later by Western blotting. The resulting hybridomas with positive ELISA response are frozen for further testing at the Veterinary Research Institute in Brno, where the entire practical part of this thesis was carried out. These frozen hybridomas are further tested by immunoprecipitation to conclude this thesis.
The aim of this master‘s thesis is to prepare a monoclonal antibody against cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). The theoretical part focuses on antigen-antibody binding, which is essential for the use of monoclonal antibodies in the determination of CDK13 as well as the transcription that this kinase affects. This section is also devoted to Western blot and ELISA methods for detection of newly generated antibodies. Furthermore, the antibodies and the antigen definition are stated, which are later on discussed. The practical part is devoted to the preparation of antigen - its isolation and purification on a peristaltic pump. It also addresses immunization, its course, and the amount of antigen used to immunize mice. After immunization, the work focuses on fusion of sp-2 cells and splenocytes, which were first removed from the immunized mouse and purified. After the fusion alone, selection of hybridomas on HAT selection medium is mentioned, followed by detection first by ELISA and later by Western blotting. The resulting hybridomas with positive ELISA response are frozen for further testing at the Veterinary Research Institute in Brno, where the entire practical part of this thesis was carried out. These frozen hybridomas are further tested by immunoprecipitation to conclude this thesis.
Description
Citation
ŠUPÁK, M. Příprava myších monoklonálních protilátek proti cyklin-dependentní kináze 13 [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
sk
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2019-05-30
Defence
1. Diplomant seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce.2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.3. Diplomant akceptoval všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděl v plné šíři.Diskuseprof. Márová: Hybridomy jste si připravoval sám? Můžete popsat postup jejich přípravy? K čemu jste využíval průtokový cytometr?doc. Diviš: U stanovení kalibrační křivky albuminu nemáte v práci bod (0,0). Můžete popsat, kterou metodou byla kalibrační křivka měřena, jaké bylo použito činidlo.doc. Brázda: Pro další práci bych doporučil se více vědecky vyjadřovat. Můžete uvést, která metoda byla použita pro izolaci antigenů u E. coli? Jaká byla čistota antigenů po izolaci?Po diskuzi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomant prokázal velmi dobrou orientaci v dané problematice i schopnost samostatné prezentace získaných výsledků.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení