Izolace a stanovení struktur proteinů: hexamerin potemníka Tribolium Castaneum a TmpH fága phi812
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Tato práce se zabývá strukturní studií dvou proteinů: proteinu Tail morphogenetic protein H (TmpH) bakteriofága 812, který napadá Zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) a hexamerinu z potemníka (Tribolium castaneum). S. aureus je jedním z nejvíce rezistentních patogenů způsobující onemocnění s vysokou morbiditou a mortalitou. Bakteriofág 812 je schopen infikovat a lyzovat 95 % kmenů S. aureus a má potenciální využití ve fágové terapii. Protein TmpH je součástí virionu tohoto fága. V rámci této práce bylo připraveno několik plazmidů nesoucích gen TmpH, které byly použity pro rekombinantní expresi proteinu v buňkách E. coli BL21(DE3). Protein byl vyčištěn afinitní a gelovou chromatografií. Pro čistý protein byly optimalizovány krystalizační podmínky. Hexamerin je nejhojnějším proteinem larev a kukel hmyzu s dokonalou proměnou. V průběhu metamorfózy hexamerin slouží jako zdroj aminokyselin. V rámci této práce byl hexamerin izolován z kukel potemníka T. castaneum. Pro stanovení struktury hexamerinu byly použity dvě metody: rentgenová krystalografie a kryo-elektronová mikroskopie. Byly optimalizovány podmínky pro růst krystalů a vypěstovány krystaly vhodné pro sběr difrakčních dat. Nicméně struktura hexamerinu byla rychleji vyřešena kryo-elektronovou mikroskopií s rozlišením 3.2 . Znalost struktury hexamerinu umožní pochopení jeho funkce v regulaci vývoje hmyzu s dokonalou proměnou.
This thesis deals with structural studies of two proteins: Tail morphogenetic protein H (TmpH) from phage 812, which infects Staphylococcus aureus, and hexamerin from holometabolous beetle Tribolium castaneum. S. aureus is one of the bacterial pathogens that are most often resistant to antibiotics and cause diseases with high morbidity and mortality. Bacteriophage 812 infects and lyzes 95 % S. aureus strains and it is a potential agent for use in phage therapy. Protein TmpH is a part of the virion of this phage. As a part of the work on this thesis several plasmids carrying TmpH gene were prepared and used for recombinant protein expression using E. coli BL21(DE3). The produced protein was purified using affinity and size exclusion chromatography. Crystallization conditions for TmpH were optimized. Hexamerin is the most abundant protein in larvae and pupae of Holometabolous insects. It serves as an amino acid source during the metamorphosis of pupae into adults. I developed the method for isolation of hexamerin from pupae of T. castaneum. Two methods were used to determine hexamerin structure: X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. Conditions for hexamerin crystallization were optimized and crystals suitable for X-ray data collection were grown. Nevertheless, hexamerin structure was solved by cryo-electron microscopy at resolution of 3.2 . The structure of hexamerin may enable determination of its role in regulation of metamorphosis of holometabolous insects.
This thesis deals with structural studies of two proteins: Tail morphogenetic protein H (TmpH) from phage 812, which infects Staphylococcus aureus, and hexamerin from holometabolous beetle Tribolium castaneum. S. aureus is one of the bacterial pathogens that are most often resistant to antibiotics and cause diseases with high morbidity and mortality. Bacteriophage 812 infects and lyzes 95 % S. aureus strains and it is a potential agent for use in phage therapy. Protein TmpH is a part of the virion of this phage. As a part of the work on this thesis several plasmids carrying TmpH gene were prepared and used for recombinant protein expression using E. coli BL21(DE3). The produced protein was purified using affinity and size exclusion chromatography. Crystallization conditions for TmpH were optimized. Hexamerin is the most abundant protein in larvae and pupae of Holometabolous insects. It serves as an amino acid source during the metamorphosis of pupae into adults. I developed the method for isolation of hexamerin from pupae of T. castaneum. Two methods were used to determine hexamerin structure: X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. Conditions for hexamerin crystallization were optimized and crystals suitable for X-ray data collection were grown. Nevertheless, hexamerin structure was solved by cryo-electron microscopy at resolution of 3.2 . The structure of hexamerin may enable determination of its role in regulation of metamorphosis of holometabolous insects.
Description
Citation
VALENTOVÁ, L. Izolace a stanovení struktur proteinů: hexamerin potemníka Tribolium Castaneum a TmpH fága phi812 [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
en
Study field
Chemie pro medicínské aplikace
Comittee
prof. Ing. Miloslav Pekař, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Petr Dzik, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (člen)
Date of acceptance
2019-05-29
Defence
Student prezentoval řešenou práci, její teoretická východiska a vlastní výsledky, zodpověděl dotazy položené oponentem a následně byly poleženy dotazy členů komise. Dzik: Prosím objasněte vztah mezi vznikem proudového signálu a sorpčními procesy na elektrodě.Pekař: Jaké bylo uspořádání elektrochemického měření, jaká byla referenční a protielektroda?Obruča: Proč máte na úvodním snímku obrázek ze Sixtinské kaple?Zdráhal: Můžete porovnat vlastnosti elektrochemické metody s hmotnostní spektrometrií? Z jakých zdrojů jste čerpal pro popis reakcí formamidu v rané atmosféře? Student prokázal výbornou orientaci v dané problematice a schopnost samostatné prezentace získaných výsledků.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení