Metody identifikace PHA produkujících bakterií
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Diplomová práce se zabývá testováním, optimalizací a porovnáním metod vhodných pro identifikaci bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty. V rámci práce byly využity metody kultivační a mikroskopické, kde byly bakteriální buňky barveny lipofilními barvivy Nilská červeň a Sudánová čerň. Dále byla využita průtoková cytometrie a metody spektroskopické, a to Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací a také metody molekulárně biologické, kde byla analyzována přítomnost genu kódujícího PHA syntázu (phaC) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR test se skládá ze dvou reakcí, v první reakci je phaC gen amplifikován společně s 16S rRNA oblastí společnou pro všechny bakterie (multiplexní PCR). Druhá reakce je pak specifická pro PHA syntázu katalyzující biosyntézu mcl-PHA. Podle výsledků práce je při identifikaci PHA produkujících kmenů za účelem eliminace falešně pozitivních výsledků metod analyzujících genotyp a falešně negativních výsledků metod zkoumající fenotyp kombinovat oba přístupy. Jako velice perspektivní se jeví kombinace PCR pro stanovení přítomnosti phaC genu a následné analýzy přítomnosti PHA v bakteriálních buňkách. K tomuto účelu se nám nejlépe osvědčila Ramanova mikrospektroskopie, která je schopna zachytit i nízký obsah PHA v buňkách a zároveň nehrozí záměna PHA za jiné lipidické látky. Výsledky práce poskytují přehled testovaných metod, jejich výhody a nevýhody a také porovnání různých kritérií, dle kterých je možné vybrat metodu identifikace v závislosti na nastavených požadavcích.
This diploma thesis deals with testing, optimazing and comparing methods for the identification of bacteria producing polyhydroxyalkanoates. Work included cultivation and microscopy methods, wherein the bacterial cells were stained with lipophilic dyes Nile red and Sudan black. Further, we also used flow cytometry and spectroscopic methods - Raman spectroscopy and infrared spectroscopy with Fourier transformation, and molecular biological methods, which analyzed the presence of a gene encoding PHA synthase (phaC) by polymerase chain reaction (PCR). PCR assay consist of two reactions, the firt on eis based on amplification of phaC gene along with 16S rRNDA gene, which is common for all the bacteria (multiplex PCR). The second reaction is focused on specific amplification of PHA synthase catalyzing biosynthesis of mcl-PHA. In order to overcome false positive results typical for methods analyzing genotype and also to avoid false negative results occuring in fenotype analyzing methods, the best strategy is to combine both aproaches. According to our results, analysis of presence of phaC gene by PCR can be combined with methods capable of determining presence of PHA in bacterial cells. For this purpose, Raman microspectroscopy seems to be very promising tool, since it is able to detect low content of PHA in cells and PHA can not be confused with other lipid metabolites. The results provide an overview of test methods, their advantages and disadvantages and also to compare different criteria according to which it is possible to choose the method of identification in depending on the adjustable requirements.
This diploma thesis deals with testing, optimazing and comparing methods for the identification of bacteria producing polyhydroxyalkanoates. Work included cultivation and microscopy methods, wherein the bacterial cells were stained with lipophilic dyes Nile red and Sudan black. Further, we also used flow cytometry and spectroscopic methods - Raman spectroscopy and infrared spectroscopy with Fourier transformation, and molecular biological methods, which analyzed the presence of a gene encoding PHA synthase (phaC) by polymerase chain reaction (PCR). PCR assay consist of two reactions, the firt on eis based on amplification of phaC gene along with 16S rRNDA gene, which is common for all the bacteria (multiplex PCR). The second reaction is focused on specific amplification of PHA synthase catalyzing biosynthesis of mcl-PHA. In order to overcome false positive results typical for methods analyzing genotype and also to avoid false negative results occuring in fenotype analyzing methods, the best strategy is to combine both aproaches. According to our results, analysis of presence of phaC gene by PCR can be combined with methods capable of determining presence of PHA in bacterial cells. For this purpose, Raman microspectroscopy seems to be very promising tool, since it is able to detect low content of PHA in cells and PHA can not be confused with other lipid metabolites. The results provide an overview of test methods, their advantages and disadvantages and also to compare different criteria according to which it is possible to choose the method of identification in depending on the adjustable requirements.
Description
Citation
SKŘIVANOVÁ, V. Metody identifikace PHA produkujících bakterií [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2016.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (místopředseda)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2016-06-02
Defence
1. Diplomantka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce.
2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.
3. Diplomantka akceptovala všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděla v plné šíři.
Diskuse
-
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení